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Tema IV: Bibliotecas de ADN

Algunas Técnicas que permitieron transferir información genética de un organismo a otro

- desarrollo de vectores - enzimas de restricción permite generar moléculas recombinantes - técnicas de transformación

Clonación molecular

Animación
http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/plasmidcloning_fla.html

Biblioteca genómica Clonado de genes eucariotas

transcriptasa reversa ARN

ADNs

ADNd

¿Cómo seleccionamos el clon recombinante que nos interesa?

Selección del clon recombinante buscado
La selección se realiza en medio sólido La selección puede basarse en: resistencia a antibióticos características nutricionales (marcadores auxotróficos) resistencia a compuestos tóxicos

Réplica en placa Selección del clon de interés

a) Por hibridación con sondas de ADN

Otros métodos de selección se basan en la expresión de la proteína codificada por el gen de interés: b) inmunodetección: utilización de un anticuerpo específico para la proteína de interés asociado con un anticuerpo que de una reacción colorimétrica c) Detección de una actividad enzimática característica

Expresión de los genesclonados
En procariotas: Promotor Sitio de unión del ribosoma Señal de terminación

En eucariotas es similar pero con los componentes que permiten la transcripción y traducción eucariota

Vector de Expresión

- promotor - terminador - sitio de unión a ribosoma (en procariotas) - sitios único de corte de enzimas - marcadores genéticos - orígen de replicación - tamaño pequeño

El nivel deexpresión depende del promotor y del número de copias del vector de expresión Número de copias del vector de expresión: depende del orígen de replicación que tenga puede ir desde una copia hasta cerca de 100 (1-4: bajo número de copia; 10-100: alto número de copia) Promotores Constitutivos: siempre están transcribiéndose Regulables: se mantienen “apagados” y son inducidos por algún cambio en elmedio (inductor, cambio de T) Fuerza del promotor: determina el nivel de transcripción

Clonado y expresión de proteínas heterólogas no está limitado a procariotas como hospederos, también se han utilizado eucariotas (Ej. S. cerevisiae, P. pastoris, A. niger) La ingeniería genética también se aplica a plantas y animales Los principios básicos son similares La ingeniería genética no quedarestringida a la expresión de proteínas sino que también utiliza otras herramientas como: - deleción de genes - desregulación de rutas metabólicas - generación de diversidad

Librería de cADN

Otras técnicas utilizadas en ingeniería genética: Mutagénesis sitio dirigida:

Mutagénesis dirigida en casette: deleción, interrupción o desregulación de genes

Purificación de proteínas recombinantesAlgunos sistemas de expresión se han desarrollado de forma que permitan un proceso de purificación simple de la proteína recombinante Proteínas de Fusión: Adición de una cola de His - purificación en columna de Ni

Fusión con proteína de unión a maltosa - columna de amilosa Fusión con glutatión transferasa - columna de glutatión

Hospederos para sistemas de expresión Escherichia coliSaccharomyces cerevisiae Picchia pastoris Baculovirus Cultivos celulares (líneas celulares de mamíferos) Animales o plantas transgénicos Criterios de elección de un sistema de expresión Rendimiento Facilidad de purificación Necesidad de modificaciones post-traduccionales Preferencias de uso de codones Costos Diseño experimental

Resumen de los procesos básicos

Secuenciación de ADN
Método de Sanger(Nobel en 1980) Utiliza dideoxinucleotidos (ddNTPs) para terminar una reacción de síntesis de ADN

in-vitro

Realizando 4 reacciones independientes (una para cada base) se puede inferir la secuencia original

Secuenciación automática
Sigue el mismo principio A diferencia del método anterior cada ddNTP se marca con una molecula fluorescente diferente Esto permite realizar una unica...
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