Agrobacterium

Genética Molecular y Biotecnología Vegetal. Laboratorio de Biología Molecular Vegetal.

Módulo práctico I. Facultad de Ciencias.

MODULO I: TRANSFORMACIÓN DE PAPA CON AGROBACTERIUM El módulo consiste en la transformación de plantas de papa con una construcción conteniendo el gen gusA bajo el control del promotor constitutivo CaMV 35S, mediante el uso de Agrobacterium tumefaciens.Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium es una bacteria Gram negativa, capaz de infectar plantas dicotiledóneas, a través de heridas, e inducir la formación de agallas en las plantas infectadas. Las cepas virulentas de Agrobacterium contienen un plásmido, denominado Ti (Tumor-inducing) de un tamaño que varía entre los 130 y los 230 kb. El plásmido Ti determina las características de la agalla y la producciónde aminoácidos poco comunes denominados opinas (nopalina, octopina). Una cepa de Agrobacterium que produce la formación de una agalla que sintetiza por ejemplo octopina, tiene también la capacidad de catabolizar octopina. Las plantas son incapaces de catabolizar éstos aminoácidos, por lo que Agrobacterium puede desviar el metabolismo de la planta para producir compuestos que únicamente la bacteriapuede utilizar. El mecanismo de infección de Agrobacterium involucra la transferencia y la integración de una región del plásmido Ti al genoma nuclear de la célula vegetal. Esta región se denomina T-DNA (Transfer-DNA). El T-DNA contiene genes que codifican para algunas fitohormonas (auxinas y citoquininas) y para la síntesis de opinas. Estos genes se expresan únicamente al ser integrados algenoma. Uso del plásmido Ti como vector de transformación de plantas. La técnica de transformación de plantas es una herramienta para la investigación de la función de genes de plantas y un método muy importante para la biotecnología de plantas. Mediante la manipulación del mecanismo natural de infección de Agrobacterium se han podido generar una serie de vectores que permiten la introducción desecuencias de ADN de interés a los genomas nucleares de varias plantas superiores. El sistema binario (en dos partes) se ha podido desarrollar gracias a dos características del mecanismo de transferencia del T-DNA: a) Las secuencias necesarias para la integración al genoma se encuentran en los bordes del T-DNA (secuencias repetidas terminales), pudiendo ser reemplazado el resto de la secuencia delT-DNA. b) Los genes de virulencia (vir) responsables de la transferencia del T-DNA, actúan en trans, por lo que no tienen que estar situados en el mismo plásmido que el T-DNA. El sistema binario consiste en: • Una cepa de Agrobacterium con un plásmido Ti “desarmado”. Este plásmido contiene todos los genes vir pero no contiene el T-DNA, por lo que no es oncogénico pero es capaz de transferir el T-DNApresente en otro plásmido más pequeño (vector binario).

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Un plásmido vector que contiene los bordes del T-DNA. Este plásmido es pequeño y de fácil manipulación en E. coli para el clonado de secuencias. No presenta los genes para la producción defitohormonas ni opinas. Presenta sitios de restricción múltiples dentro de los bordes del T-DNA para el clonado de secuencias. Contiene también un marcador para la selección de las células transformadas, como por ejemplo, resistencia a kanamicina, herbicida o marcador metabólico.

Transformación de plantas. Las técnicas de transformación de plantas utilizando Agrobacterium tumefaciens varían según laplanta. En general, se deben adaptar los métodos de manipulación y cultivo de células y tejidos vegetales, así como los métodos de infección con Agrobacterium y la posterior selección de las células transformadas. La selección de las células transformadas se realiza dependiendo de la construcción utilizada. Los métodos de transformación para la generación de plantas transgénicas consisten en...