AISLAMIENTO DE DNA BACTERIANO


Preparación de DNA humano genómico
Introducción
El objetivo de este experimento es para aislar y purificar una gran cantidad de alto peso molecular ADN humano. La fuente del ADN será su células de la mejilla obtenidas a partir de un enjuague bucal solución salina (una incruenta y no invasiva procedimiento). Usted también aprenderá cómo determinar la concentración de ADN y la pureza. El ADNaislado se puede utilizar en varios experimentos que que llevará a cabo más adelante en el curso. El procedimiento es un "híbrido" entre los métodos de extracción con fenol y cloroformo, precedidas de proteinasa K la digestión.
Se llevará a cabo este experimento durante dos períodos de laboratorio. El primer período incluirá el procedimiento para la recolección de células y los pasos inicialesde purificación de ADN. Durante el segundo periodo los estudiantes laboratorio terminar el aislamiento de ADN y determinar la concentración de ADN y la pureza.
Antecedentes
ADN constituye un pequeño porcentaje del material celular y por lo general se localiza en una parte definida de la célula. En las células procariotas el ADN se condensa altamente y localizada en una estructura llamadanucleoide, que no está separado de el resto de la savia de la célula por una membrana. En las células eucariotas la mayor parte de ADN es localizada en el núcleo, que está separada del resto de la savia de la célula por una complicada estructura de la membrana. Por lo general, aproximadamente el 90 por ciento de la ADN se localiza en el núcleo (cromosomas); el resto se puede separar en otros orgánulostales como mitocondrias o cloroplastos. En los virus y bacteriófagos, ADN está encapsulado por la capa de proteína y constituye entre 30 y 50 por ciento de la masa total del virus. La cantidad de ADN, como un porcentaje de la masa total de material celular en procariotas y eucariotas, es mucho menor que el de los virus y es menos de 1 por ciento.
Por ejemplo, la composición aproximada de divisiónrápida Escherichia coli células y células humanas (HeLa) se dan en la Tabla 1.1. El objetivo de la purificación de ADN es separar el ADN de todos los componentes de la celda que aparece en la Tabla 1.1. No hay ninguna dificultad en la separación de ADN de moléculas pequeñas ya que el peso molecular del ADN es muy grande.
Por lo tanto, los componentes que constituyen las "principales impurezas" ydeben ser eliminado son proteínas y ARN. Hay varios métodos de purificación de ADN que explotan las diferencias en las propiedades físicas entre el ADN y las proteínas. Todos los métodos de purificación involucra cinco pasos esenciales.
1. la rotura de la célula.
2. La eliminación de las proteínas.
3. La eliminación de ARN.
4. concentración de ADN.
5. Determinación de la pureza y cantidadde ADN.

La rotura de la célula
La rotura de la célula es uno de los pasos más importantes en la purificación de ADN. Los medios habituales de apertura de células, tales como sonicación, molienda, mezcla o alta presión, no se puede utilizar en la purificación de ADN. Estos procedimientos se aplican fuerzas fuertes para abrir las células que la cizalladura del ADN en pequeños fragmentos. lomejor procedimiento para abrir las células y la obtención de ADN intacto es mediante la aplicación de química (detergentes) y / o procedimientos enzimáticos. Los detergentes pueden solubilizar los lípidos en las membranas celulares resultantes en la lisis celular suave. Adicionalmente, detergentes tienen un efecto inhibidor sobre todos los DNasas celulares y pueden desnaturalizar proteínas, ayudandode ese modo en la eliminación de proteínas a partir de la solución. El lisis de las células animales se realiza por lo general el uso de detergentes aniónicos tal como SDS (deodecyl sulfato de sodio) o Sarcosilo (deodecyl de sodio sarcosinato).
La eliminación de Proteína
El segundo paso en la purificación implica la eliminación de un contaminante importante, a saber, la proteína, a partir...