Aislamiento recombinante

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39. Aislamiento y purificación del DNA de un plásmido recombinante
Aurora Galván Cejudo, Manuel Tejada, Antonio Camargo, José Javier Higuera, Vicente Mariscal, Emilio Fernández Reyes
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba

RESUMEN

El DNA de un plásmido recombinante presente en una bacteria se aísla por unmétodo rápido y sencillo (“miniprep”) que consiste en lisis bacteriana, precipitación de proteínas y DNA genómico, y finalmente precipitación del DNA plasmídico. El objetivo es obtener suficiente cantidad del DNA para su análisis posterior mediante electroforesis. Palabras clave: DNA plasmídico, lisis alcalina, eficiencia de la purificación Abreviaturas empleadas. DNA: ácido desoxirribonucleico; IPTG,isopropil-β-Dtiogalactopiranósido; LB: medio de Luria-Bertani; RNasa, Ribonucleasa.

1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosómico, circular y generalmente de pequeño tamaño que se encuentran en muchas especies bacterianas y que se pueden replicar de manera independiente del DNA cromosómico. A diferencia de éste, los plásmidos no son necesarios para laviabilidad general de la célula, pero pueden contener genes que contribuyen a la supervivencia en condiciones especiales, como los que confieren resistencia a antibióticos, a metales etc. Algunas clases de plásmidos poseen además la propiedad conocida como "replicación relajada", esto es, están presentes en forma de muchas copias por célula, lo que facilita enormemente su aislamiento y purificación. Losplásmidos poseen un interés singular en Ingeniería Genética por ser uno de los sistemas vectores más sencillos de usar. Un vector de clonación es un sistema que permite introducir en una célula hospedadora un fragmento de DNA que se pretende clonar; en esta célula hospedadora el vector se replica y expresa, en su caso. La molécula que resulta de la unión de un DNA vector con el DNA de interés(denominado entonces "inserto") se denomina molécula de vector recombinante. Para ser utilizado como vector de clonación, un plásmido ideal debe poseer al menos tres características: 1) Debe tener su propio origen de replicación y por tanto la capacidad de replicación autónoma independiente del genoma del hospedador. 2) Debe tener sitios de clonación múltiple que permitan la apertura del DNA conenzimas de restricción y hace posible la clonación de insertos de
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DNA en la forma y orientación determinada. 3) Debe poseer marcadores genéticos seleccionables que permitan aislar las células hospedadores que contengan el vector. La mayoría de los plásmidos naturales no cumplen todas estas condiciones, por lo que una primera tarea de la Ingeniería Genética ha consistido en la construcción deplásmidos artificiales, combinando en una misma molécula diversos rasgos útiles procedentes de los plásmidos naturales. La presencia en el plásmido del gen de resistencia a ampicilina permite seleccionar las bacterias que portan estos plásmidos, gracias a su capacidad para crecer en presencia de dicho antibiótico (el gen de resistencia codifica una beta lactamasa, enzima que degrada la ampicilina). Lamayoría de los plásmidos usados en Biologia Molecular contienen el sitio de clonación múltiple dentro el gen de la β-galactosidasa lo que permite la interrupción e inactivación de este gen cuando un DNA inserto se clona en esta región. En medios de cultivo que contengan el análogo de la lactosa X-gal, esta estrategia permite distinguir las colonias bacterias que contienen el vector recombinante(con inserto) de aquellas que han recibido un vector no recombinante (sin inserto). Las bacterias que reciben el vector recombinante no pueden utilizar lactosa ni su análogo y formará colonias blancas. Las bacterias que reciben un vector no recombinante sí pueden utilizar la lactosa o su análogo y formarán colonias azules. El objetivo de esta práctica consiste en la purificación del DNA del...
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