aminoácidos y proteínas



Objetivo:
Aplicar pruebas cualitativas generales y específicas que permitan reconocer grupos químicos de los aminoácidos y proteínas.
Someter soluciones de proteínas a desnaturalización con agentes físicos y químicos.

Marco teórico:
Prueba de Ninhidrina:
La ninhidrina es un poderoso agente y reactivo común para visualizar las bandas de separación de aminoácidos por cromatografía oelectroforesis, también es utilizada con fines cuantitativos para la determinación de aminoácidos.
Reacciona con todos los aminoácidos alfa cuyo pH se encuentra entre 4 y 8, dando una coloración que varía de azul a violeta intenso. Este producto colorido (llamado púrpura de Ruhemann) se estabiliza por resonancia, la coloración producida por la ninhidrina es independiente de la coloración originaldel aminoácido
Esta prueba es positiva tanto para proteínas como para aminoácidos. en aquellos casos donde no da positiva la prueba de biureth y da positiva la de ninhidrina, indica que no hay proteínas, pero si hay aminoácidos libres.
La Reacción Xantoproteica:
Los aminoácidos, que contienen un núcleo aromático forman nitro-derivados de color amarillo cuando se calientan con ácido nítricoconcentrado. Las sales de estos derivados son de color naranja intenso en medio alcalino. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali, se torna color amarillo oscuro. La fenilalanina, la tirosina y en cierto grado el Triptófano, así como todas las proteínas que los contienen, dan positiva la prueba.
Según las guías químicas es una reacción cualitativa, más no cuantitativa. Por endedetermina la presencia o no de proteínas. Para cuantificar se usa otra reacción, como la de Biureth, y se hace un análisis espectro fotométrico.
Reacción para el triptófano:
Este aminoácido se condensa fácilmente con varios aldehídos en presencia de ácidos fuertes para dar compuestos coloreados. En la reacción se utiliza el reactivo de Ehrlich (p-dimetilaminobenzaldehído al 10% en HCL concentrado.)que reacciona con un buen número de compuestos orgánicos tales como índoles, aminas aromáticas y compuestos ureicos para dar complejos coloreados.
Reacciones para cisteína y cistina
Cuando los aminoácidos y las proteínas que contienen grupos tiólicos se calientan en medio fuertemente alcalinos, el azufre presente reacciona para formar sulfuros. Este sulfuro puede detectarse por la formación de unprecipitado negro de sulfuro de plomo por adición de acetato de plomo. Los grupos tioles también reaccionan con el nitroprusiato de sodio en presencia de un exceso de amoníaco para dar un complejo de color rojo.
Prueba de Biureth:
Es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida. Elreactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta. El Hidróxido de Potasio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar.
Desnaturalización por calor y pH extremos:
Una pérdida de la estructura tridimensional suficiente para causar pérdida de la función se llamadesnaturalización. Se forma un conjunto de cadenas polipeptídicas con distinto grado de plegamiento. La desnaturalización no significa que siempre se obtenga la cadena polipéptidica totalmente desplegada. Los productos de desnaturalización en solución se agregan físicamente y según las condiciones de pH y fuerza iónica, precipitan.
El objetivo de elegir un paso de purificación desnaturalizante es crearlas condiciones donde la proteína de interés no se desnaturalice mientras que los otros componentes se desnaturalicen y precipiten.
Precipitación con cationes y aniones pesados y sales concentradas:
Los cationes de metales pesados y los aniones de elevado peso molecular son muy usados en la separación de proteínas y en la preparación de filtrados libres de proteínas. A pH neutro por lo general...