Amplificacion De Dna Por Pcr

INTRODUCCIÓN
La técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que permite amplificar o clonar rápidamente muestras pequeñas de DNA, es decir, aumentar su cantidad de modo que sea suficiente para poder analizarlas. (1) Esta técnica fue descubierta por Kary Mullis en 1986 el cual en 1993 recibió el premio Nobel de Química por su descubrimiento, causando revuelo y unaherramienta útil en el trabajo de laboratorio forense, microbiano, genético, y paleontológico.(2)
El PCR copia secuencias especificas de DNA mediante una serie de reacciones in vitro y puede amplificar secuencias diana de DNA presentes en cantidades infinitesimales entre una población de otras moléculas de DNA. (3) Esta amplificación selectiva requiere alguna información previa acerca de lassecuencias que flanquean el DNA blanco. Sobre la base de esta información se diseñan dos oligonucleótidos cebadores (o también llamados primers) de alrededor de 15 a 30 nucleótidos de longitud, el cual son complementarios de las secuencias por fuera de los extremos 3´y 5´del sitio blanco y se unen a ellas en forma especifica para servir de punto de partida para la síntesis de nuevas cadenas de DNAcomplementarias al DNA diana. (4)
Luego las moléculas de DNA de cadena doble se desnaturalizan para separarlas a cadenas simples en donde servirán como molde para la síntesis de una nueva cadena, y luego se renaturalizan (se vuelven a unir) con una cadena complementaria en condiciones controladas. Esta técnica es una reacción en cadena de 25 a 35 ciclos. Cada ciclo, involucra tres reaccionescontroladas rigurosamente en tiempo y temperatura en termocicladores automáticos.(4)
Se pueden identificar tres reacciones o pasos en cada ciclo que son:
• Desnaturalización del DNA de cadena doble, alrededor de 93-95oC
• Unión de los cebadores o primers al ADN de cadena simple 50- 70oC
• Síntesis del DNA mediante DNA polimerasa termo resistente (70-75oC) que extiende los cebadores añadiendonucleótidos en dirección 5´a 3´haciendo una copia de doble cadena del DNA diana. (taq polimerasa obtenido de la bacteria Thermophilus aquaticus)

PCR MIMIC, es una técnica utilizada para la cuantificación de ácidos nucleicos, en el cual se utiliza de un DNA mimic interno de concentración conocida que compite con el ADN problema y que comparten la secuencias de reconocimiento por los partidores con losque se realiza el PCR. Este DNA mimic con concentración y volumen conocido se agrega junto al DNA problema de concentración desconocida a la reacción de amplificación por PCR, en la cual se deja correr en un gel de agarosa y se cuantifican sus concentraciones mediantes un grafico de densitometría de las bandas generadas, lo que permite determinar cuantitativamente la abundancia de DNA aamplificar. (5)

Los objetivos de este práctico de laboratorio tienen cabida a la familiarización y a la utilización de la técnica de PCR como una herramienta útil dentro de la Biología en general y la determinación de la concentración de DNA de Nurr1 de una muestra problema utilizando la técnica de PCR MIMIC.






1)http://books.google.cl/books?id=Nxb3iETuwpIC&pg=PA258&dq=reaccion+en+cadena+de+la+polimerasa&hl=es&sa=X&ei=bcS9T6KbMYXvggeN7bSpDw&ved=0CDIQ6AEwAA#v=onepage&q=reaccion%20en%20cadena%20de%20la%20polimerasa&f=false
3) KLUG, Williams. CUMMINGS, Michael. SPENCER. Charlotte. Conceptos de Genética.
8ª Edición. Editorial Pearson, Madrid, 2006. P. 541
4)http://books.google.cl/books?id=bgQ_xyJYkigC&pg=PA60&dq=reaccion+en+cadena+de+la+polimerasa&hl=es&sa=X&ei=bcS9T6KbMYXvggeN7bSpDw&ved=0CEQQ6AEwAw#v=onepage&q=reaccion%20en%20cadena%20de%20la%20polimerasa&f=false
5) SIEBERT PD, LARRICK JW. PCR MIMICS: competitive DNA fragments for use as internal standards in quantitative PCR. Biotechniques., 1993. 14(2). Pp. 244-9.
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MATERIALES Y METODOS

Materiales:

-Guantes
-Hielo
-Termociclador
-Tubos eppendorf grandes y pequeños
-Micropipetas P10,...