Amplificación de un fragmento de dna del gen sry empleando la reacción en cadena de la polimerasa

PRACTICA 2
AMPLIFICACIÓN DE UN FRAGMENTO DE DNA DEL GEN SRY EMPLEANDO LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

INTRODUCCIÒN
La reacción en cadena de la polimerasa o PCR (por sus siglas en ingles Polymerase Chain Reaction) es un método in vitro de síntesis de ADN con el que un segmento particular de este es específicamente amplificado al ser delimitado por un par de cebadores o iniciadoresque lo flanquean. Su copiado se logra en forma exponencial a través de repetidos ciclos de diferentes periodos y temperaturas de incubación en presencia de una enzima DNA polimerasa termoestable. Así se obtienen millones de copias de la secuencia deseada del DNA.
La PCR es una técnica de biología molecular altamente específica, rápida, sensible y versátil para detectar cantidades ínfimas de uncierto DNA específico, posibilitando su fácil identificación. Al principio, su inventor enfrentó dos problemas fundamentales: uno era que en cada ciclo había que añadir la enzima DNA polimerasa, ya que ésta se inactivaba con las temperaturas tan altas demandadas para desnaturalizar el DNA y exponer las bases nitrogenadas de sus nucleótidos. Otro inconveniente era que había que hacerlo manualmenteen tres baños mantenidos a las diferentes temperaturas requeridas, pasando rápidamente la muestra de un baño al otro y luego al último, repitiendo esto varias decenas de veces.5 El descubrimiento de una bacteria (Thermus aquaticus) que vive en aguas termales junto a geissers a 75°C, la cual tiene una DNA polimerasa que funcionaba bien a altas temperaturas (72°C) e incluso es estable a 94°C,supuso un gran avance, ya que sólo tenía que ser añadida al principio y se mantenía activa durante todo el proceso. Esto, junto con el diseño de los termocicladores o aparatos que consisten en un bloque que puede ser programado para calentarse y enfriarse rápidamente en determinados tiempos, condujo a la automatización total del proceso. La reacción consta, por lo regular, de 30-40 ciclos repetitivosconformados cada uno de tres pasos: 1. Desnaturalización: ruptura de los puentes de hidrógeno del DNA, para lo que se incuba a una temperatura de alrededor de 95ºC, por un minuto. 2. Alineamiento o Hibridación de los cebadores o iniciadores a las cadenas desnaturalizadas del DNA blanco, a una temperatura que facilita el apareamiento de las bases nitrogenadas complementarias de ambas clases deDNAs. Esta temperatura depende de la temperatura de fusión (Tm) de los iniciadores, la cual depende de su contenido de bases (generalmente entre 50 y 60°C). 3. Polimeraización, la polimerasa va añadiendo a los iniciadores, los diferentes nucleótidos libres en el orden que le va dictando la secuencia de nucleótidos de la cadena que actúa como molde, se efectúa a 72ºC. Para realizar una PCR en ellaboratorio se necesita mezclar en un tubo el ADN que contiene la secuencia a amplificar, dos cebadores (oligonucleótidos o primers) que se alinearán a las cadenas simples del ADN, la mezcla de los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfatados (dNTPs) en cantidades suficientes, la enzima ADN polimerasa termoestable, el buffer de reacción para la polimerasa, y agua destilada para completar el volumenfinal de reacción (que normalmente oscila entre 20-100 µl). Posteriormente se colocan los tubos en el termociclador para que ocurran los ciclos de amplificación.
Por otro lado, la PCR en tiempo real, que inicialmente se conocía como “kinetic PCR” fue descrita por primera vez en 1993 por Higuchi et al. Se trata de un ensayo cuantitativo para amplificar ADN, la reacción de amplificación es similara la previamente descrita, con la variante de usar un termociclador con sensores para medir la fluorescencia tras exitar el fluoroforo a una longitud de onda apropiada los fluoroforos son agentes quimicos que emiten fluorescencia, adicionados a la mezcla de la reacción, evitando así la necesidad de visualizar los fragmentos amplificados en geles de agarosa. La cinetica de la acumulación de la...