Extraccion dna-pcr

LABORATORIO N°2

Extracción de ADN y Herramientas Moleculares: PCR

INTRODUCCION: Extracción de ADN genómico
Bacterias, hongos, mamíferos y vegetales corresponden a la biomasa encontrada en nuestro planeta. Cada uno de ellos está compuesto por células, que a su vez poseen información genética dada por la molécula de ADN y ARNs que codifican para polipéptidos. La habilidad paraaislar DNA puro desde una variedad de organismos es un paso crucial para muchos estudios realizados en biología molecular.
La estructura de las bases del ADN Bases nucleotídicas: Purinas A = Adenina, G = Guanina Pirimidinas C = citosina, T = Timina
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Existen distintos métodos para extraer ADN desde diferentes tejidos, lo cual está dado principalmente por el tipo deestructuras celulares presentes en un organismo u otro. Sin embargo, toda extracción de ADN posee como mínimo tres pasos fundamentales: lisis celular, desnaturación de proteínas y precipitación del ADN. En el caso de la extracción de DNA desde tejidos animales (eucariontes) se utilizan soluciones que contengan principalmente detergentes (como SDS o Tritón 100X) y proteasas (proteinasa K) con el fin dedegradar componentes proteicos de las membranas celulares. La utilización de la mezcla de fenol:cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1) es necesaria para la extracción de las proteínas de la muestra, para finalmente precipitar el ADN con etanol absoluto o bien con isopropanol para evitar que precipiten algunas sales junto con el ADN.
Para bacterias, se debe tener en consideración la presenciao no de pared celular, para el caso de Gram positivas, debe utilizarse lisozima con el fin de digerir su pared celular. Sin embargo, para Gram negativas no se requiere dicha digestión ya que poseen una delgada capa de péptidoglican que puede ser digerida con SDS a 37ºC por un tiempo de incubación más prolongado. En levaduras, debido a que sus componentes externos difieren a los encontrados enbacterias, el cultivo debe incubarse con liticasas o zimolasas. Una vez generado los esferoplastos deben lisarse por medio de un cambio brusco de temperatura, para posteriormente continuar con el método clásico de extracción de proteínas y precipitación del ADN.
En vegetales, el gran obstáculo que debe superarse es la gran cantidad de polisacáridos que se encuentran en la superficie, paraello el tejido debe disgregarse por medio de nitrógeno líquido con el fin de facilitar la lisis celular. El método de extracción se basa en la utilización de un buffer denominado CTAB, el cual es un detergente catiónico que forma un precipitado en soluciones con una alta fuerza iónica complejos compuestos por proteínas y polisacáridos, además de contar con potentes agentes desnaturantes comoβ-mercaptoetanol.
Existen métodos alternativos para la extracción de ADN, que permiten obtener ADN con un mayor grado de pureza y en algunos casos en menor tiempo. Es así por ejemplo que métodos basados en Sílica, cuyo fundamento radica en la absorción del ADN en estas esferas en presencia de una alta concentración de sales caotrópicas, permite obtener ADN puro y con poca fragmentación. Tambiénencontramos purificaciones realizadas por medio de gradiente de CsCl y columnas de cromatografía de intercambio iónico.
El ADN extraído puede observarse mediante geles de agarosa. Está formado por un polímero helicoidal de D – Galactosa y 3,6 – anhidro L – Galactosa ,que permite la separación de moléculas cargadas utilizando un campo eléctrico generado mediante la utilización de doselectrodos, además de una solución de electrolitos que permite la adecuada migración en el gel. Los geles de agarosa permiten la separación de fragmentos de ADN que varían desde 0,5 – 25 Kb.
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Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa 1% teñido con bromuro de etidio, de ADN genómico extraído de. Carriles: 1 ; células eucariontes, 2; bacteria (E.coli),...