Bacteriologia

Unidad II
“Bacteriología”

Introducción

Para facilitar la manipulación y el análisis de los genes, es necesario tener muchas copias de las secuencias de ADN utilizadas. Un problema importante en el campo molecular, es que cada gen es una muy pequeña porción del ADN celular final, y por lo tanto, para poder estudiarlo, se necesita aislarlo y amplificarlo previamente.
En la actualidad, latécnica que hace posible amplificar fragmentos cortos de ADN se conoce como reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la cual permite obtener miles de millones de copias en sólo unas horas.
El PCR se basa en la replicación catalizada por una ADN polimerasa (Taq Polimerasa) y tiene dos requisitos fundamentales: 1) un molde de ADN monocatenario a partir del cual puede copiarse una nueva cadena deADN y 2) un cebador con un grupo 3’-OH al que pueden agregarse los nuevo nucleótidos. (Genes, 512-513)
En términos generales, los pasos involucrados en el proceso son los siguientes:
1. Desnaturalización (separación completa de las cadenas) por calor de la doble hebra de ADN que se va a amplificar, en presencia de un exceso de los oligonucleoótidos iniciadores (cebadores o primers).
2.Apareamiento a la temperatura adecuada o alineamiento: al enfriarse, los primers se aparean con los sectores complementarios de cada una de las hebras y así señalan el sitio del comienzo de la replicación.
3. Extensión: Se agregan ADN polimerasas y los desoxinucleótidos trifosfatos a la mezcla para comenzar el ensamble de una nueva cadena a partir del extremo 3’de cada uno de los iniciadores,constituyendo el primer ciclo del PCR.
4. La misma reacción se repite varias veces (varios ciclos) resultando una acumulación exponencial de copias de alrededor de 2n, siendo n el numero de ciclos. El proceso se lleva a cabo en un termociclador, el cual permite fijar las temperaturas, los tiempos y el número de los ciclos deseados.
Una vez amplificado el ADN, el método convencional paraseparar moléculas de diferentes longitudes y para su posterior análisis, es la electroforesis en gel. Los fragmentos se cargan en pequeñas ranuras (denominadas pozos) de una sustancia parecida a un gel llamada agarosa y se pasa corriente eléctrica a través de él, provocando que los fragmentos de ADN migren a través de los poros separándolos por tamaño (Recordar que el ADN presenta carga negativa debidoa los fosfatos que posee en su estructura). Los fragmentos más pequeños migrarán más rápido y más lejos que los grandes.
Para seguir el proceso de la electroforesis se añaden uno o dos colorantes con velocidades de migración conocidas a las muestras de ADN antes de cargarlas. El patrón que se resulta de los fragmentos de ADN se visualizan embebiendo el gel en solución de bromuro de etidio,compuesto que se intercala entre los pares de bases del ADN y emite fluorescencia cuando es activado por radiación ultravioleta.
Ahora bien, cuando se desea incorporar y expresar en una nueva célula el fragmento de ADN en estudio, se requiere de un “vehículo” que pueda introducir el gen dentro de esta. En bacterias, el proceso por el cual los genes se transfieren de una bacteria a otra se conoce como“transformación” y aquellas bacterias que tienen la capacidad de incorporar el ADN foráneo se denominan “competentes”. La competencia se puede ver afectada por el estado fisiológico de las células, el medio en el que se encuentran y la etapa de su ciclo de crecimiento (fase exponencial y fase estacionaria temprana). (Romero, 2007)
La transformación experimentalmente, consiste en hacer penetrarun fragmento de ADN en una bacteria para provocar en ella una recombinación genética. Para mejorar la eficiencia de este proceso, se puede hacer uso de los denominados vectores de clonación. En E. coli, el organismo que más se emplea en clonación y el mejor conocido funcional y molecularmente, se utilizan 3 vectores de clonación: los plásmidos, los bacteriófagos y los cósmidos. Los plásmidos...