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EXAMEN BIOLOGIA DE PLANTAS II
PROF. REYNA OSUNA FERNANDEZ.

5.- De manera general explica en qué consisten las siguientes técnicas utilizadas en el estudio de los fitorreguladores: HPLC (cromatografía líquida de alta presión), GC (cromatografía de gases), MS (espectrometría de masas) y radioinmunoensayo.(4)

5.1. HPLC (cromatografía líquida de alta presión)

La cromatografía es unmétodo físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil. En cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija.
La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la cual está rellena con la fase fija.Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació latécnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.

Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenómeno físico que provoca la separación, la cromatografía líquida de alta resolución puede ser:

1. Cromatografía de adsorción. La fase fija es un sólido y se utiliza casi exclusivamentesílice (sílica) y en mucha menor medida alúmina.

2. Cromatografía de reparto. En casi todos los casos, como fase estacionaria se utilizan compuestos unidos químicamente a un soporte sólido de sílica. Se la subdivide encromatografía en fase normal y fase reversa. En la cromatografía en fase normal, la fase fija es polar (como por ejemplo agua o trietilenglicol) y los compuestos menos polareseluyen primero. En la cromatografía en fase reversa, el compuesto unido químicamente es un hidrocarburo alifático y se emplean fases móviles polares. En este caso, las sustancias más polares eluyen primero.

3. Cromatografía iónica. Se utilizan columnas rellenas con resinas de intercambio iónico para separar y determinar iones.

4. Cromatografía de exclusión por tamaño. La fase fija estáformada por partículas poliméricas o de sílice que contienen una red uniforme de poros y llevan a cabo un fraccionamiento realcionado con el tamaño molecular. Las moléculas de tamaño mayor son excluídas y eluyen primero, mientras que las más pequeñas que penetran en los poros son retenidas más tiempo.

La fase móvil puede ser un solvente puro o una mezcla de solventes. Cuando se trata de unamezcla, puede programarse la bomba para que tome solventes de diferentes botellas en una proporción determinada y realice la mezcla en una cámara de mezclado. Cuando durante toda la separación se utiliza siempre el mismo solvente, se denomina isocrática, sin embargo es
HPLC 2 normal realizar un gradiente de composición del solvente a lo largo de la cromatografía para mejorar la eficiencia y acortar laduración del proceso. Estos gradientes de solvente también son realizados en forma automatica por las bombas.
La bomba envía al solvente a través de caños de diámetro pequeño, generalmente de acero inoxidable, hacia la válvula inyectora. Esta consiste en una válvula de seis vías que permite introducir en el flujo de solvente, la muestra contenida en un aro o loop de volumen calibrado.
Luego deque se produzca la separación en la columna, los componentes de la mezcla pasan por el detector. Este produce una señal eléctrica proporcional a la cantidad de materia y esa señal es enviada al registrador que realiza un gráfico de intensidad en función del tiempo (cromatograma).

Idealmente, se trata de picos gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la muestra original. El...
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