Bioquimica

[pic][pic]



Introducción.

Las bacterias son organismos procariontes, es decir carecen de núcleo, y esto afecta directamente en la aplicación y resultado de la tinción bacteriana. Las bacterias son prácticamente hialinas o transparentes y a causa de esto se necesita de una tinción especial para su observación, estudio, análisis y clasificación. El uso de colorantesbiológicos permiten aumentar el contraste de la bacteria con el medio ambiente y con la aplicación de tinciones especiales se pueden observar los organismos que se encuentran en ella, esto si cabe decir que ante cualquier proceso de tinción en la bacteria se altera su forma física y estructural o se provoca la muerte de la misma.

Existen dos tipos de tinciones: tinciones simples y tincionesdiferenciales. Lo que diferencia estos tipos de tinción es la cantidad de colorantes utilizado en la tinción. Como la palabra lo dice la tinción simple usa solo un colorante, por lo tanto se tiñen en forma homogénea y solo permiten observar forma y agrupación celular; en cambio la tinción diferencial se utilizan dos colorantes distintos y entre ellos decolorantes químicos, esta tinción permite identificardistintos tipos de bacterias. En el desarrollo del laboratorio se utilizara la tinción de Gram la cual siguiendo un procedimiento nos dará a conocer si la bacteria es una Gram positiva o negativa, las Gram negativas se verán de un color rosado o rojizo y las Gram positivas de un color morado. La diferencia de estos resultados esta dada en el proceso de decoloración por uso de alcohol-acetona, lasGram positivas no se decoloran, sino que mantiene el color del colorante, que en este caso es la safranina que tiñe de un color morado la muestra; y las Gram positivas si se decoloran, por eso al observarlas al microscopio se observan de un color rojizo.

Objetivos.

-Realizar una tinción diferencial, mediante la técnica de Gram y preparar un frontis adecuado para su respectiva observaciónmicroscópica.

-Determinar la clasificación Gram y el tipo morfológico a la cual pertenecen las bacterias estudiadas.

Materiales.

- Solución de violeta cristal o violeta de genciana.
- Yodo o lugol, etanol al 75%
- Etanol al 95% + acetona.
- Safranina o fucsina fenicada
- Agua destilada
- Asa bacterióloga.
- Mecheros
- Portaobjetos.Procedimiento.

A.- Fijación y tinción:

- Con la ayuda del mechero flamear el asa bacteriológica y esperar a que se enfrie.
- Tomar el asa y coger un poco de muestra, hacer que esta tome contacto con la lámina portaobjeto, la cual servirá para extender la muestra sobre la misma.
- Esperar a que se seque al aire libre (no lo ponga a llama directa del mechero porque el calor excesivo puedeprovocar cambios en la morfología celular)
- Una vez obtenido el frotis con la muestra, se procede a teñir la misma con violeta de genciana (safranina); utilice una cantidad suficiente como para cubrir la muestra por completo. Deje actuar por 1 minuto.
- Enjuague el frotis con agua teniendo cuidado de no hacer caer el chorro directo a la lamina, sino que caiga en la parte superior del frotis yde este modo escurra sobre ella. Además el chorro debe ser delgado.
- Una vez enjuagado y eliminado el exceso de violeta se aplica como mordiente el yodo o Lugo durante 1 minuto.
- Decolore ahora el frotis con etanol, hasta que ya no escurra mas liquido azul, utilice el gotario del frasco hasta que la lámina quede totalmente transparente (considere que un exceso de muestra o de pigmento puedeimposibilitar su observación microscópica).
- Lavar con agua una vez más para quitar los excesos de decolorante y esperar a que la muestra se seque al aire libre.

B.-Coloración de contraste:

- Para poner en manifiesto las bacterias Gram negativas mediante coloración de contraste, se tiñe nuevamente con un colorante de contraste, en este caso safranina. Deje actuar 1 minuto.
-...