Bradford Bioqca Lab

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Determinación de la concentración de proteínas mediante el método de Bradford.
Integrantes: Oriel Muñoz Díaz
Christian Armijo Carrillo
Asignatura: Bioquímica
Facultad de Química y Biología
Profesor: Deborah Vargas
INTRODUCCIÓN
Conocer la concentración de una proteína en una muestra biológica, es un análisismuy común tanto en toma de exámenes, purificación de proteínas, determinación de la actividad específica enzimática, entre otros. Es así como surgen diversos estudios enfocados en determinar la concentración proteica en una muestra problema, usando a nuestro favor características presentes como la propiedad intrínseca de la proteína para absorber luz en UV, la tendencia a unirse a ciertoscolorantes o la formación de derivados químicos.
Es así, como se conocen variadas técnicas de determinación de concentración a partir de cualidades presentes en las proteínas, entre ellos podemos mencionar el método de Biuret, método de Lowy, BCA, método de Brandford, por nombrar algunos. Es de gran importancia tener presente las limitaciones de cada método, para así escoger el adecuado según nuestrosrequerimientos, exigencias y recursos.
En el siguiente informe se expondrán los resultados de la determinación de la concentración proteica, utilizando el método de Brandford, este se basa en el cambio de color del colorante Azul Brillante de Coomassie G-250, en respuesta a diferentes concentraciones de proteínas. Este compuesto interacciona con aminoácidos básicos y aromáticos. Esta unión delcolorante con las proteínas provoca un cambio en el máximo de absorción del colorante a 595 nm. Por lo tanto, este método se basa en la propiedad del Azul Brillante de Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con colores diferentes, café y azul. La forma café se convierte en azul cuando el colorante se une a la proteína y se midió experimentalmente la absorbencia de las fracciones a una amplitud deonda de 595 nm.
Luego para medir la concentración de proteínas, tenemos que relacionar la absorancia con la concentración, para ello nos basamos en la ley de Lambert- Beer, la cual explica que hay una relación exponencial entre la transmisión de luz de una sustancia y está expresada como
A = ε·c·l(1)
Donde:
A = absorbencia
ε= Coeficiente de extinción molar
l = longitud de la celda.Siendo ε una medida de la cantidad de luz absorbida por unidad de concentración, la cual deberá ser despejada posteriormente, a partir de la ecuación arrojada por la gráfica al aplicar el ajunte correspondiente al comportamiento que describe la Ley de Lambert-Beer. La longitud de celda se le asigna el valor 1, ya que en su mayoría los equipos están diseñados para ese valor y de esta forma el cálculoquede aún más sencillo.
METODOLOGÍA
Primero, elaboramos una curva de calibración, la que se trabajo con BSA a una concentración conocida de 1 [mg/mL], y utilizmos reactivo de Bradford disponible comercialmente con una dilusion de 1:5.
Disponemos de 10 tubos eppendorf, los que contendrán 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 20 y 30 µg de BSA los cuales se tomaran con una micropipeta, y luegoenrasaremos cada tubo eppendorf hasta 50 µL con agua destilada, y luego se agrega 950 µL del reactivo de Bradford. Esta mezcla se ambienta y se deja reposar durante 5 minutos para luego medir la absorbancia a una longitud de onda de 595 nm.
Segundo, determinaremos la concentración de nuestras proteínas separadas anterior mente en el practico 1, mediante medición de absorbancia a 595 nm.
Para ello tenemosque preparar los tubos a partir de las fracciones seleccionadas del practico 1 (los que fueron el número 5, 8, 10, 11, 12, 13, 14 y 15) tomando 10 µL de cada dicha fracción, luego se enrasa a 50 µL con agua destilada y se agregan los 950 µL del reactivo de Bradford, se deja reposar por 5 minutos y se mide absorbancia a los 595 nm en el espectrofotómetro.
DATOS
Tabla 1:Preparación de los...