CLOROFILA

PRÁCTICAS DE FISIOLOGÍA VEGETAL
(Guiones elaborados por los profesores de prácticas)
PRIMER CUATRIMESTRE

Lugar:

Laboratorio de docencia de Fisiología Vegetal
Departamento de Biología Vegetal

Los alumnos deberán traer:
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Bata de laboratorio

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Pinzas, bisturí, tijeras

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Trapo o toallitas

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Una patata grande

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Una cebolla

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Rotulador de vidrio

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SEPARACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEPIGMENTOS DE CLOROPLASTOS
Introducción
En los cloroplastos se diferencian dos tipos de pigmentos:
Clorofilas: Son pigmentos fotosintéticos cuya estructura está constituida por un tetrapirrol
cerrado con varios sustituyentes laterales (Figura 1). El anillo tetrapirrólico contiene un ión Mg2+
en el centro complejado con los nitrógenos de dicho núcleo y un sistema de dobles enlaces
conjugados cuyoselectrones son los responsables de la absorción de la radiación del espectro
visible. En el anillo IV se encuentra unido el fitol, una cadena hidrocarbonada que forma un
enlace éster con un propionilo del anillo. En las plantas existen dos tipos de clorofilas (a y b)
que se diferencian en el sustituyente R en el ciclo II del anillo tetrapirrólico (Figura 1). Las
clorofilas presentan máximos de absorciónpróximos a los 400 y 600 nm (Figura 3). Ninguna de
ellas absorbe en el verde, lo que les da su color característico.
Carotenoides: Son moléculas hidrocarbonadas de 40 átomos de carbono. Los carotenoides
que participan en la fotosíntesis son de dos tipos: tipo caroteno y tipo xantofila (Figura 2). Los
carotenoides tipo caroteno constan exclusivamente de carbono e hidrógeno. Los carotenoides
tipoxantofila contienen oxígeno además de carbono e hidrógeno. El sistema conjugado de
dobles enlaces es el responsable de la absorción de luz en el espectro visible. Su espectro de
absorción muestra máximos de absorción entre los 450 nm y 500 nm, correspondientes al azul
y al verde (Figura 3), por lo que la luz roja-anaranjada-amarilla que reflejan les proporciona su
color característico.

ClorofilasFigura 1. Estructura de la clorofila

2

Carotenoides
Carotenos

Xantofilas

γ-caroteno

Violaxantina

Luteína

α-caroteno

β-caroteno

Zeaxantina

Figura 2. Estructura de algunos carotenoides

Figura 3. Espectro de absorción de algunos pigmentos fotosintéticos

3

PARTE 1.- Separación de pigmentos mediante cromatografía en papel
Objetivo y desarrollo de la práctica
El objetivo de la práctica esextraer y separar los diferentes tipos de pigmentos de cloroplastos
por cromatografía en papel en función de su polaridad relativa. Una vez separados, se
analizará su migración a lo largo de la fase estacionaria.

Extracción de pigmentos:
Comenzamos la experimentación con la extracción de los pigmentos de cloroplastos de 0.5
gramos de hojas frescas de espinacas o de cualquier otro material verde,con 5 ml de acetona
al 80%, disgregando el tejido vegetal en un mortero, de modo que se extraigan los pigmentos y
se disuelvan en acetona. Cuando la acetona está bien verde, el macerado se introduce en un
tubo de centrífuga de plástico y se centrífuga a 2000 rpm durante 10 minutos. Después de
centrifugar se obtiene un sobrenadante verde que contiene los pigmentos.

Realización de lacromatografía:
Se dispone de una tira de papel whatman nº1 (fase estacionaria) en la que se dibuja con lápiz
una línea a 1-2 cm de uno de sus extremos. Sobre el centro de esta línea se deposita una gota
pequeña del sobrenadante verde con una pipeta pasteur de vidrio. Esperamos a que se seque
y aplicamos una nueva gota en el mismo punto de aplicación que la anterior, repitiendo la
operación hasta añadir 7 a 8gotas. Se introduce con cuidado la tira de papel con la muestra en
un tubo de ensayo que contiene 2 ml de la fase móvil (acetona:éter de petóleo, 1:9 en
volumen).
El extremo del papel que ha de quedar más próximo a la fase móvil es el que tiene la muestra.
Esta no puede quedar sumergida en la fase móvil. Se deja durante unos 30 minutos en la
oscuridad. Al cabo de este tiempo se saca la tira de...