concentacion de proteinas

Para el análisis de la preparación de inmunoglobulinas es necesario saber su concentración de proteínas.
Utilizaremos el método del Ácido Bicinchonínico (BCA). Este método depende principalmentede que, en un medio alcalino, los enlaces peptídicos de las proteínas reducen Cu++. Los iones Cu+ producidos, se unen a dos moléculas de BCA y al hacerlo, les cambian la estructura electrónica de talmanera que ahora absorbe luz a 562 nm y aparecen púrpura. En las condiciones de la reacción, la absorción del compuesto es proporcional a la concentración de proteína presente.
Para establecer larelación entre una cierta concentración de proteína y una cierta absorción, se prepara una serie de muestras estándares de proteína que tienen concentración conocida, se lleva a cabo la reacción y sedetermina, en un espectrofotómetro, la absorción de cada muestra. Se acostumbra hacer una gráfica con estos valores. En el eje de las X se localizan la concentración en µg/ml y en el de las Y, laabsorción, en unidades de absorción. Allí se localizan los puntos que corresponden a una determinada concentración y su respectiva absorción. La línea sugerida por los puntos de los estándares indica larelación entre proteína concentración y absorción.
Paralelamente se lleva a cabo la reacción con las muestras experimentales. En la gráfica se puede leer entonces a qué concentración de proteínacorresponde la absorción producida por estas muestras.


Preparación del Reactivo de Trabajo

Mezcle: 10 mls. del Reactivo A (BCA, en condiciones alcalinas) con
0.2 mls. del Reactivo B(4% de Sulfato de Cobre)

Preparación de la serie de estándares.

A partir de una solución comercial de 2000 µg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) prepare 8 microtubos que contengan:1200, 1000, 800, 600, 400, 200, 100 y 0 µg/ml.
Para preparar 1 ml de:
1200 mezcle 600 ul de la solución de BSA y 400 ul de diluyente (PBS)
1000...