Cuantificación espectrofotométrica de proteínas por el método de biuret

Práctica N°8

Cuantificación espectrofotométrica de proteínas por el método de Biuret

Objetivo: determinar la concentración de proteínas del suero de la sangre.
Introducción:
El principal método de referencia para determinar la concentración de proteínas es el análisis del contenido de nitrógeno. La técnica de Kjeldahl consiste en una digestión ácida de los compuestos que contienennitrógeno, liberando iones amoniaco y titulación como base o mediante tratamiento con reactivo de Nessler, con el cual los yoduros dobles (potásicos y mercúricos) forman un complejo coloreado con amoniaco en medio alcalino. Mientras que la determinación en contenido de nitrógeno puede ser extremadamente precisa, su utilidad para el cálculo de la concentración proteica depende de la composición proteicaexacta de la muestra, dado que las proteínas tienen un contenido en nitrógeno variable en función de su composición aminoacídica. Sin embargo para una muestra de una proteína purificada el contenido en nitrógeno es altamente exacto para estimar la concentración de proteínas, pero naturalmente debe haber sido medido previamente para ser utilizado en los cálculos de las muestras de prueba. Elconocimiento de la composición y secuencia de aminoácidos de las proteínas permite un cálculo exacto de cuál debe ser su contenido en nitrógeno. Como las muestras clínicas constan de mezclas imprevisibles de diferentes proteínas y la medición de contenido en nitrógeno no es una operación simple, no se utiliza corrientemente en los laboratorios clínicos.
Otros métodos para cuantificar proteína incluyen:Índice de refracción, absorción de luz ultravioleta, turbidimetría , Folin-Ciocalteu, Lowry, azul brillante de Coomassie, ninhidrina y Biuret. En esta práctica se empleará el método colorimétrico de Biuret, altamente especifico para las proteínas y los péptidos (desde tripéptidos); consiste en que las sales de cobre em solución alcalina forman un complejo púrpura con sustancias que contienen dos omás enlaces peptidicos. Las interferancias son minimas, si bien el ion amonio puede acidificar la reacción, mientras que la bilirrubina y la hemoglobina absorben en la misma región del complejo de biuret (540 a 560 nm). La reacción del biuret es muy utilizada en laboratorios clínicos, especialmente en analizadores automatizados, en los que se puede determinar concentraciones proteicas de hasta 10o 15 mg/dl.

Material y reactivos:
• 8 tubos de ensaye de 16x150 mm limpios y secos
• 1 gradilla
• 1 pipeta de 5 ml graduada 1/100
• 2 pipetas de 1 ml graduadas 1/100
• 1 Micopipeta de 1000μl
• Albúmina sérica bovina al 1% en NaCl al 0.85%
• NaCl al 0.85%
• Reactivo deBiuret
• Espectrofotómetro Spectronic 20 D y celdas respectivas

Procedimiento:
1.-Preparación de una curva dacalibración. A la siguiente serie de tubos de ensayo adicione los reactivos como están indicados:
Tubo no. 1 2 3 4 5 6
Albumina al 1% (ml) 0 0.2 0.4 0.8 1.6 3.2
NaCl al 0.85% (ml) 4 3.8 3.6 3.2 2.4 0.8
Reactivo de Biuret (ml) 5 5 5 5 5 5

Mezclar suavemente y dejar reposar por 30 minutos a temperatura ambiente. Medir la absorbancia en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 550 nm. ,utilice el tubo No. 1 para calibrar a cero la absorbancia en el instrumento. Con los resultados obtenidos se construye en papel milimétrico, una curva de calibración colocando en las abcisas las absorbancias obtenidas y en las ordenadas, la concentración en mg/ml de albúmina.
2.- Determine la concentración de proteínas de una muestra de suero. En un tubo de ensayo adicione 0.1 ml de suero, 3.9 ml deNaCl al 0.85% y 5ml del reactivo de Biuret y proceda de la misma manera que con los tubos de la curva de calibración. La absorbancia obtenida interpólela en la curva de calibración para conocer la concentración de proteínas séricas.

Resultados:
Las concentraciones estándar de albumina se calcularon usando el siguiente procedimiento:
Ejemplo para el tubo n°2:
0.2mL de albumina al 1%
1mL...