Cuantificación de proteínas por espectrofotometría

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE VALPARAISO
FACULTAD DE AGRONOMÍA

QUI-343
BIOQUÍMICA
INFORME Nº 1: ESPECTROFOTOMETRÍA: CUANTIFICACIÓN



2do. Semestre 2010
Introducción

La absorción de luz por parte de una sustancia es una propiedad característica de ella, que puede ser utilizada para su identificación y cuantificación. Todas las sustanciasabsorben luz en alguna región del espectro electromagnético (VIS, UV, IR, etc.). La absorción de luz depende de la estructura química del compuesto absorbente, y en especial de ciertos grupos funcionales, de modo que es posible identificar un compuesto por medio de las características de su espectro de absorción.

Para medir este valor de absorción se utiliza el espectrofotómetro. Unespectrofotómetro es un instrumento para medir la transmitancia o absorbancia de una muestra, en función de la longitud de onda de la radiación electromagnética. Todo método espectrofotométrico se basa en la comparación de la absorbancia de una sustancia de concentración desconocida con la de una solución de la misma sustancia cuya concentración se conoce y a la cual se denomina solución patrón o estándar.La absorbancia de una solución es la resultante de la absorbancia del soluto cuya concentración se desea conocer y la de otros componentes del sistema (solventes, reactivos) que absorben también a esa longitud de onda. Estos compuestos se denominan interferencias. Se debe descartar la absorbancia de las interferencias, para ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga todos loscomponentes del sistema menos aquel que se desea medir, esta muestra se llama blanco, y la absorbancia de esta debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien, con el blanco se calibra el instrumento a absorbancia igual a 0, es decir un 100% de transmisión.

Al medir la absorbancia de una serie de soluciones de concentración conocida de una misma sustancia, tratadas con el mismométodo y en el mismo instrumento a igual longitud de onda se puede graficar mediante regresión lineal una curva de calibrado, con la cual posteriormente se puede determinar gráficamente la concentración de una muestra desconocida, mediante la ecuación: A = ε l c + Ao, donde A es la variable dependiente (y), la pendiente es igual a (ε ◦ l), c es la variable controlada (x) y Ao es elintercepto con el eje y.

En general, no hay un método completamente satisfactorio para medir la concentración de proteínas en una muestra y la elección del método depende de la naturaleza de la proteína, de los otros componentes de la muestra problema, de la rapidez y sensibilidad deseada.

En este informe se presentan dos de los métodos que se usan corrientemente para medirconcentraciones de proteínas. Uno es el método de Biuret, que se basa en la medición de absorbancia en tubos con una cantidad de proteína determinada y que se tratan con Reactivo de Biuret. El compuesto Biuret forma un complejo coloreado rosado o violeta con el ión Cúprico, en solución básica. El color se debe aparentemente al complejo de coordinación del Cu con cuatro átomos de nitrógeno, que participan enel enlace peptídico. Este método requiere una alta concentración de proteínas para la formación de color. La sensibilidad del método es de 0,25-200 mg de proteínas por ml de solución.

El otro método es el de Lowry, En el método de Lowry, la muestra se trata con el reactivo de Folin – Ciocalteau modificado. Si hay proteínas presentes, se produce una coloración azul debidoprincipalmente a la presencia de residuos de tirosina y triptofano en las proteínas. Esta reacción se produce ya que la tirosina, debido a su grupo hidroxifenilo, reacciona con una solución de ácido fosfomolíbdico tungstico en un medio cúprico alcalino, produciendo coloración azul, la cual absorbe a 650 nm. Luego, se mide la absorbancia a esta longitud de onda y se compara con las medidas obtenidas...