Curso De Genética

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Tema 1
ADN recombinante
Manipulación in vitro de ácidos nucleicos (ADN)
Enzimas que actúan sobre ácidos nucleicos: proteínas purificadas extraídas de bacterias. De manera
natural forman parte del ciclo celular normal.
- ADN polimerasas: sintetizan ADN
- Nucleasas: cortan o degradan
- Enzimas de modificación de extremos: para conseguir residuos concretos
- Ligasas: unen fragmentos deADN
Nucleasas
Enzimas que degradan ADN y/ o ARN rompiendo los enlaces fosfodiéster entre nucleótidos. Se
clasifican según su actividad:
- Exonucleasas: eliminan nucleótidos de los extremos hacia el interior de la molécula. No ataca a
moléculas circulares.
- Endonucleasas: cortan en medio de la molécula o cadena
Pueden ser específicas de ADN o ARN, de cadena simple (ss) o doble (ds)Ejemplos:
• Exonucleasa del fago
: ADN ds 5’ 3’
• Exonucleasa III: ADN ds 3’ 5’
• Nucleasa Bal31: exonucleasa 3’ 5’ específica de ADN ds. También es endonucleasa sobre
ARN ss
• Nucleasa S1: endonucleasa de ss, tanto ADN como ARN. También corta la segunda cadena
de molécula ds cuando hay una muesca
• DNasa I: específica de ADN. Corta preferentemente en pirimidinas (C y T). Uso en
producciónde muescas y mapeo de unión de proteínas. Endonucleasa
• RNasa A: específica de ARN ss. Elimina ARN presente en preparaciones de ADN y la
cadena de ARN en un híbrido ADN: ARN
• RNasa H: actividades endonucleasa, exo 5’ 3’ y exo 3’ 5’ sobre ARN presente en
híbridos híbrido ADN:ARN
Endonucleasas de restricción o restrictivas
Catalizan el corte de moléculas de ADNds en sitios específicos. Losfragmentos obtenidos son
específicos y se denominan fragmentos de restricción.
Reconocen una secuencia corta bicatenaria: sitio o diana de restricción
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Forman parte de los sistemas de restricción-modificación (RM) bacterianos, no ataca al ADN
bacteriano porque está metilado. Defensa /protección frente a la entrada de ADN extraño.
Sistemas RM
Desempeñan, en la célula bacteriana, unafunción de protección genética, dirigida a impedir el
establecimiento en su interior de material genético exógeno que pudiera codificar productos capaces de
alterar la vida celular.
El sistema incorpora dos actividades enzimáticas ambas con una misma especificidad de secuencia.
- Metilasa: metil-transferasa (M). la metilación protege al ADN en sitios específicos
- Endonucleasa (R): cataliza larotura de las dos hebras de ADN si no se encuentra metilada al
menos una de ellas.
El sitio o diana de reconocimiento es una corta secuencia de pares de bases, constituido por las dos
hebras
Hay tres tipos de sistemas RM:

Sistemas RM tipo I: tienen tres subunidades (metilasa, restrictasa y especificidad). Reconocen y
metilan una secuencia, pero el corte se produce fuera de la diana dereconocimiento y en secuencia
no específica

Sistemas RM tipo III: tienen dos subunidades: metilación /especificidad y restricción. El corte se
produce fuera de la diana de reconocimiento.

Sistemas RM tipo II: Actividad restrictasa y metilasa en proteínas distintas. Reconocen y actúan
sobre la misma secuencia (diana de reconocimiento). Rotura en sitios específicos y definidos.
Tipos I y IIITipo II
Endonucleasas de restricción tipo II
Son de una gran especificidad, actúan sobre una diana concreta
 Nomenclatura: EcoRI
- 3 primeras letras indican género y especie de donde se aisló
- 4ª letra indica cepa
- Número romano indica orden de aislamiento
 Dianas
- Secuencia ADNds: cataliza la hidrólisis simultánea de las dos hebras de un ADN bicatenario y no
actúa sobre estructurasmonohebra.
- Entre 4-8 bp (pueden ser más). Constituida por una secuencia específica de algunos pares de bases.
- Generalmente palindrómicas
 Punto de rotura simétrico respecto del eje de la diana, uno en cada hebra. Pueden producir
extremos:
- Romos: rotura en enlaces enfrentados
- Cohesivos (5’ protuberantes o 3’ protuberantes): rotura en enlaces no enfrentados
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Romos Cohesivos
5’...