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Biología Molecular y Celular

Lic. Marcelo F. Goyanes

ADN Recombinante
Hasta las postrimerías de 1970, el ADN era una molécula que presentaba amplias dificultades para su análisis bioquímico. Su gran longitud y monotonía hacían que la secuencia de nucleótidos pudiese sólo ser estudiada mediante mecanismos indirectos. Para esto se recurría a la determinación de la secuencia de las proteínaso del ARN. Hoy la situación ha cambiado por completo y el ADN ha pasado a ser una de las moléculas más fáciles de estudiar. Mediante las técnicas que desarrollaremos en este capítulo, veremos que es factible separar regiones determinadas del ADN, obtenerlas en grandes cantidades y determinar su secuencia de nucleótidos a una velocidad de varios cientos de nucleótidos al día. También se nos haceposible alterar un gen (sometido a ingeniería) y transferirlo a células en cultivo o a la línea germinal de animales, donde el gen modificado se incorpora como parte funcional y permanente del genoma. La tecnología del ADN recombinante constituye una suma de técnicas siendo las más importantes: La rotura específica del ADN mediante nucleasas de restricción, que facilita el aislamiento y lamanipulación de los genes individuales. La secuenciación rápida de todos los nucleótidos de un fragmento purificado de ADN, que posibilita determinar los límites de un gen y la secuencia de aminoácidos que codifica. La hibridación de los ácidos nucleicos que hace posible localizar secuencias determinadas de ADN o ARN, utilizando la capacidad que tienen estas moléculas de unirse a secuenciascomplementarias de otros ácidos nucleicos. La clonación del ADN, mediante la cual se puede conseguir que un fragmento de ADN se integre en un elemento génico autorreplicante (plásmido o virus) que habita en una bacteria, de tal manera que una molécula simple de ADN puede ser producida generando muchos miles de millones de copias idénticas. La ingeniería genética mediante la cual se pueden alterar secuenciasde ADN produciendo versiones modificadas de los genes, los cuales se pueden insertar a células u organismos. Fragmentación, separación y secuenciación de moléculas de ADN A diferencia de las proteínas, los genes no existen en unidades independientes, sino que confieren regiones de una molécula de ADN de gran tamaño. Aunque es posible fragmentar el ADN al azar, es muy difícil que estas porcionescontengan un determinado gen. Así, el purificar un determinado gen constituyó un verdadero problema hasta la aparición de las endonucleasas de restricción. Estas enzimas, que pueden aislarse de bacterias, cortan el ADN de doble cadena en lugares discretos, definidos por la secuencia de nucleótidos, produciendo fragmentos de ADN de tamaño definido. Distintas especies de bacterias fabricandiferentes endonucleasas de restricción y cada una de ellas posee especificidades de secuencia, siendo relativamente fácil encontrar una endonucleasa de restricción que libere un fragmento de ADN que incluya un determinado gen. El tamaño del fragmento liberado puede utilizarse para purificar el gen de una mezcla. Una vez purificado, puede amplificarse el fragmento de ADN

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Biología Molecular yCelular

Lic. Marcelo F. Goyanes

mediante clonación y determinarse la secuencia de nucleótidos que se encuentran en la molécula mediante la secuenciación. Las endonucleasas de restricción son producidas por un amplio número de bacterias, a las que las protegen degradando moléculas de ADN que han sido transportadas al interior de las mismas por medio de virus. Así, una bacteria puede eliminaruna porción de ácido nucleico viral que ha ingresado a su genoma. Cada enzima reconoce una secuencia específica de ADN de entre cuatro y ocho nucleótidos. Cuando estas secuencias son propias del genoma bacteriano están protegidas del corte por medio de la metilación; cuando estas secuencias se presentan en un ADN extraño, no se hallan metiladas por lo cual resultan como blanco del ataque de las...
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