Determinación De La Concentración De Proteínas Por El Método De Biuret

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BIURET

I. Introducción

Las proteínas son macromoléculas que están compuestas de aminoácidos. Están constituidas básicamente por carbono (C), hidrógeno (H), oxígeno (O) y nitrógeno (N); aunque pueden contener también azufre (S) y fósforo (P) y en menor proporción, hierro (Fe), cobre (Cu), magnesio (Mg), yodo (I). Sonimprescindibles para el organismo. Estas se utilizan con fines: Estructural (colágeno y queratina, Reguladora (insulina y hormona del crecimiento),Transportadora (hemoglobina), Inmunológica (anticuerpos), Enzimática (sacarasa y pepsina), Contráctil (actina y miosina), Homeostática: colaboran en el mantenimiento del pH, Transducción de señales (rodopsina) y Protectora o defensiva (trombina y fibrinógeno).El método de Biuret, para la determinación de proteínas, es una de los más simples en este tipo; es reproducible, pero requiere una alta concentración de proteínas para la formación de color. La sensibilidad del método es de 0,25- 200 mg de proteínas por mL de solución, se debe tener precaución con la presencia de un exceso de lípidos en los blancos es mejor desecharlos.
El reactivo de Biuretestá formado por una disolución de sulfato de cobre en medio alcalino, este reconoce el enlace peptídico de las proteínas mediante la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos, lo que produce una coloración rojo-violeta.
En el presente laboratorio se utilizo el método de Biuret parala determinación de la concentración de proteínas en el hígado de pollo y de pescado. Mediante la medición de su absorbancia se obtendrá una curva de valoración con la cual se nos hara mas fácil hallar la concentración de la muestra problema.

II. Objetivos
• Determinar la concentración de proteínas en una muestra de 6 gr. de hígado de pollo.
• Construir una recta de calibración con unasolución de albúmina como patrón para el método colorimétrico del Biuret.

III. Materiales y métodos

• Homogenizador
• Espectrofotómetro
• Blanco de biuret
• Solución estándar de proteínas

IV. Procedimiento
1. Pesar 6 gramos de hígado de pollo y adicionar 24 ml de buffer acetato pH=5. (Para el pescado pesar 3 gramos y adicionar 21 ml de buffer acetato)
2. Homogenizar y centrifugar (30minutos a 6000 rppm)
3. Separa el sobrenadante y medirlo en una probeta (extracto crudo).
4. Adicionar 0.9 ml de agua destilada en los tubos de ensayo.
5. Agregar 0.1 ml de extracto crudo en los tubos de muestra.
6. Adicionar 5 ml de reactivo de Biuret.
7. Llevar al vortex
8. Poner en baño maría por 10 minutos a 37 °C.
9. Llevar nuevamente al vortex (tubos bien secos)
10. Proceder a lalectura de la absorbancia.

V. Fundamento

El método de Biuret para medir proteínas se basa en la formación de un complejo de color violeta-púrpura entre las cadenas de péptidos y los iones Cu (II) en un medio fuertemente alcalino. La reacción ocurre con los átomos de nitrógeno de la cadena peptídica y no está influenciada significativamente por diferencias en la composición de aminoácidos. Laalbúmina es utilizada como un buen estándar parta este método.

VI. Revisión Bibliográfica
Método de biuret: Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastanteespecífica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).
Proteína + Cu+2 Complejo Cu-Proteína (púrpura)
Ventajas:
• MENOS CARO QUE EL MÉTODO DE KJELDAHL
• RÁPIDO (SE PUEDE COMPLETAR EN MENOS DE 30 MINUTOS)
• ES EL MÉTODO MÁS SIMPLE DE ANÁLISIS DE...