Determinación Espectrofotométrica Clasica Y Derivada De Pka’s De Los 1,2-Dhb

1.2. DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA CLASICA Y DERIVADA DE pKa’s DE LOS 1,2-DHB.
En esta determinación se prepara un buffer Britton-Robinson 0.04M con el cual se preparan los 1,2-DHB en distintas soluciones del Buffer, ajustándolas desde pH= 2 a pH=13.
Se utiliza un pH-metro Orion 3-star para ajustar cada solución a los pH determinados. Las medidas absorciométricas de estas soluciones serealizan en un espectrofotómetro Agilent 8453 UV-visible con arreglo de diodos como detector, en cubetas de cuarzo de 1,0cm. En los casos en los cuales fue necesario realizar las derivadas de los espectros se hace con el software ChemStation, los datos obtenidos de aquí o de los espectros sin derivar son analizados en Origin 6.0 o en Excel 2010 para determinar los pKa.
1.3.1. MétodosAplicados para calcular el pKa.
Dependiendo de cómo se comporten los 1,2-DHB al cambio de pH se analiza el método a utilizar. En el caso de que los 1,2-DHB no presentan puntos isosbésticos se utilizan los métodos: Zero Crossing, Línea base al peak y Método Seok
1.3.2.1. Método Punto Isosbéstico: La espectrofotometría clásica es una técnica basada en la obtención de espectrogramas deabsorción en función de la longitud de onda. La determinación de pKa se lleva a cabo inicialmente determinando el o los puntos isosbésticos, este corresponde al punto donde la especie H2L y la HL- son iguales[152]. Con esto, se aplica la ecuación de Henderson-Hasselbach (ecuación 1), determinando la constante de acidez respectiva, es decir pH = pKa.
pH=pKa+log⁡(HL-H2L) Ecuación 1
Para ellose selecciona un intervalo de longitudes de onda en donde se encuentra el punto Isosbéstico, seleccionando una cierta cantidad de longitudes de onda y graficando ahora Absorbancia en función del pH, obteniendo curvas del tipo sigmoidea que se cruzan, en cuyo punto se determina el pKa (pKa = pH)[152-154]
1.3.2.2. Espectrofotometría Derivada: Se utiliza para solucionar aquellossistemas en los que diferentes analitos absorben en zonas cercanas, con el objetivo de obtener la estructura fina de las bandas espectrales. Esta técnica consiste en la representación gráfica del cociente diferencial dA/dλ para la primera derivada, d2A/dλ2 para la segunda derivada, etc., en un intervalo determinado de longitud de onda. La espectrofotometría derivada obedece a todas las leyes de laespectrofotometría clásica, por ejemplo, la dependencia del valor derivado con la concentración del analito y la ley de aditividades[155, 156].
1.3.2.3. Zero Crossing: Se utiliza el valor absoluto del eje y del espectro derivado del compuesto A, a una longitud de onda donde el compuesto B (de una especie que se requiera eliminar la interferencia) debe presentar un valor igual a cero en eleje x. En estas condiciones cuando ambos compuestos estén presentes, a tal longitud de onda toda la absorción puede ser atribuida al compuesto A. Para determinar B se utiliza el mismo protocolo a una longitud de onda donde la señal en el eje “x” de la derivada del compuesto A sea cero. Las medidas realizadas a esa longitud de onda en el espectro de la mezcla, podrán ser función solamente de laconcentración del compuesto que se analiza. Cabe destacar que todas estas distancias pueden ser expresadas en unidades de derivadas (UD)[157, 158]. Cuando se hayan seleccionado las dos longitudes de onda en donde se cumple lo ya expuesto, se grafican las unidades de derivada v/s pH, determinando el pKa en el cruce de ambas curvas.
1.3.2.4. Línea base al peak: Este método se utilizó enaquellas mediciones en las cuales no había un punto Isosbéstico claro en el cual utilizar los métodos convencionales de determinación de pKa, sino que se presentaba una correlación entre pH y señales a una determinada longitud de onda, es decir, a mayor pH, mayor era la absorbancia máxima de la señal en una misma longitud de onda. Este método se basa en la ecuación de Henderson-Hasselbach...