Diagnóstico de Enfermedades en Plantas: Uso de Herramientas Moleculares

ufeffDiagnóstico de Enfermedades en Plantas: Uso de Herramientas Moleculares
Inés Marlene Rosales V.
Unidad de Biotecnología - INIA-CRI La Platina
Uno de los requerimientos más importantes para el manejo adecuado de una enfermedad es la identificación correcta del agente fitopatógeno, de forma de iniciar un tratamiento adecuado lo más temprano posible. producto del avance de la biotecnología,existen hoy en día nuevos productos y técnicas que están disponibles para complementar o reemplazar los procedimientos de laboratorio, de forma de acelerar la obtención de resultados y permitir un diagnóstico más temprano. Las técnicas moleculares para la detección de fitopatógenos han sido impactadas profundamente por dos grandes advenimientos en los últimos 30 años.
Algunas características,limitaciones y virtudes de las principales técnicas utilizadas en el diagnóstico de fitopatógenos son:
TÉCNICAS SEROLÓGICAS
Los métodos inmunológicos son ampliamente utilizados en la detección de patógenos en áreas clínicas, agrícolas y ambientales. Las inmunoglobulinas (Ig) son una familia de glicoproteínas que se encuentran en el suero y otros fluidos de los mamíferos y otros animales. Ellasforman parte del sistema inmune, son producidas en respuesta a un inmunógeno y funcionan como anticuerpos
(Figura 1

El test de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) es una técnica de
laboratorio muy sensible que es usada para detectar la presencia de antígenos o
anticuerpos de interés en una amplia variedad de muestras biológicas. Una aplicación
común del ELISA es adsorber anticuerpos alas paredes de una placa de plástico
(poliestireno), a la que posteriormente se le agregará extractos de savia de la planta
problema. Si el antígeno está presente en la muestra, éstos serán inmobilizados a las
paredes de la placa. Un segundo anticuerpo unido covalentemente a una enzima que
reconoce el antígeno inmobilizado es agregado posteriormente. La presencia en cada
pocillo de la placadel complejo anticuerpo-antígeno-anticuerpo+enzima es revelado por
el cambio de color que ocurre al aplicar un sustrato cromogénico que es utilizado por la
enzima conjugada al segundo anticuerpo. El cambio de color, y por lo tanto la presencia
del antígeno, es cuantificado por medio de la medición de absorbancia que es efectuado
es un lector de placa de ELISA.

Otra técnica que es tambiénutilizada en el diagnóstico de fitopatógenos en la inmuno impresión de tejidos, técnica que también utiliza reacciones específicas antígenoanticuerpo, y que es muy similar al test de ELISA en placas, con la excepción que en este caso la matriz sólida es una pieza especial de papel (membrana). Con esta técnica, la localización del patógeno o agente causal de la enfermedad puede ser determinadadentrodel tejido del hospedero. El tejido de la planta es presionado contra una membrana (nitrocelulosa o nylon) a la que después se le unirán los anticuerpos que se unen específicamente al patógeno. Un cambio de color indicará un resultado positivo y mostrará la localización del patógeno en el tejido del hospedero.

Otra de las técnicas serológicas disponibles para el diagnostico de agentesfitopatógenos son los test de flujo lateral. En estas pruebas, la forma más
utilizada es el inmunoensayo en formato sandwich. Un anticuerpo específico para el
antígeno blanco (patógeno) es inmobilizado en una fase sólida (membrana de
nitrocelulosa). Un segundo anticuerpo conjugado a oro coloidal, que también reconoce al
antigeno blanco, es depositado sobre esta membrana. Cuando la muestra que contieneel
antígeno es aplicada a la membrana, ésta migra a través del conjugado solubilizándolo y
formando un complejo que se mueve a través de la membrana. Este complejo es atrapado
al alcanzar el anticuerpo que está inmobilizado en la matriz, formándose un “sandwich” entre los dos anticuerpos y el antígeno. Además, se desarrolla un color que refleja la
concentración del antígeno en la muestra. La...