electroforesis de dna

Manual de trabajos prácticos Genética General

2013

Práctico n° 3: Electroforesis de DNA
Objetivos:
1.

Realizar separación electroforética de un fragmento de DNA previamente amplificado por
PCR.
Identificar los fundamentos de la separación electroforética de moléculas.

2.

Electroforesis de Ácidos Nucleicos
Este método de es uno de los más utilizados para la identificación,separación y purificación de
moléculas ya sea de DNA o RNA. En el, se utiliza una corriente eléctrica para separar moléculas
eléctricamente cargadas, las cuales se mueven bajo la influencia de un campo eléctrico uniforme.
Estas moléculas son colocadas en un medio semisólido (gel), en presencia de una solución
electrolítica tipo buffer, que permite la conducción de electricidad. La electroforesispermite separar
las moléculas de DNA por su tamaño. Un esquema básico de una electroforesis se encuentra en la
figura 3.

A

B

Figura 3: A. Representación esquemática de la electroforesis de DNA. La flecha dentro de la cámara
representa el sentido de migración del DNA (hacia el ánodo). Tanto el cátodo como el ánodo se conectan a
una fuente de poder para regular su intensidad. Debido a laconformación molecular del gel en forma de rejilla
(B), solo las moléculas de DNA más cortas o pequeñas pueden migrar una mayor distancia, mientras que las
más grandes quedan atrapadas en zonas superiores del gel.

El DNA está cargado negativamente, por lo que al ponerse en un medio al cual se le aplica un
campo electrico, tenderá a moverse hacia el polo positivo (ánodo). Cada moléculaaporta una
carga negativa, debido a la presencia de un grupo fosfato, por lo que la relación carga/tamaño es
prácticamente constante e idéntica para todas las moléculas, independientemente de su tamaño
(un nucleótido tendrá la misma movilidad y velocidad que un fragmento de doble cadena de 800 pb

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o uno de 5 kb). Debido a lo anterior, laseparación de las moleculas por tamaño se debe mas a las
propiedades del gel que de la propia molecula de DNA.
El voltaje que se aplica en los geles de agarosa depende de la resolución requerida y del tamaño
de los fragmentos a separar. A mayor voltaje, se aumenta la velocidad de la corrida del DNA, pero
se pierde resolución.

Electroforesis en geles de agarosa
Para la electroforesis de DNAse utilizan rutinariamente geles de agarosa, el cual es un
polisacárido extraído de algas de los géneros Gellidium y Gracillaria. La agarosa se solubiliza en
agua con tempertaruras cercanas a 65 °C aproximadamente, gelidificandose bajo los 40 °C y
volviendose a fundir con temperaturas cercanas a los 90 °C. Al gelidificarse, sus moleculas forman
una matriz, similar a una rejilla que restringe elpaso de las moleculas de DNA, dependiendo del
tamaño de éstas. Utilizando distintas concentraciones de agarosa, se logran grados de reticulación
diferentes. Un dsDNA lineal se mueve en un gel de agarosa a una velocidad que es dependiente
del tamaño del poro del gel. Es decir, a mayor concentración, menor sera el tamaño de los poros
que conforman la rejilla de agarosa y menor la movilidad delDNA. Cuanto mayor es el fragmento
de DNA, más se retarda a lo largo del recorrido por el gel. De esta forma, los fragmentos se van
ordenando hacia el ánodo en relación a su tamaño.

Figura 4: Esquema de preparación de un gel de agarosa. Una vez fundida la agarosa, se traspasa a un
molde de metacrilato el cual posee barreras en sus extremos (cinta o topes de goma) y que tiene los peinesubicados en las posiciones correspondientes. Cuando el gel se enfría, se solidifica, por lo que al retirar los
peines del gel, quedarán unos agujeros del tamaño de los dientes del peine. En estos agujeros se colocará la
muestra de DNA mezclada con buffer de carga. Este proceso puede hacerse antes de colocar el buffer en la
cámara (carga en seco), o cuando el gel ya está sumergido en el buffer de...