Electroforesis de proteínas y ácidos nucleicos

Informe realizado luego de realizar experiencia de laboratorio de curso de Bioquímica Experimental.









I. Introducción
En el práctico número 10, se realizó la separación de la muestra de proteínas obtenida en el práctico 8, específicamente el “extracto clarificado de hígado de rata”, y una muestra de ácidos nucleicos por electroforesis en gel, finalmente con datos obtenidos porla técnica de espectrofotometría se calculó la concentración de proteínas y ácidos nucleicos.
La obtención del “extracto clarificado de hígado de rata” fue realizada en el práctico 8, para ello fue usada la disgregación mecánica por impacto. El extracto corresponde al sobrenadante de la primera centrifugación.
La electroforesis en gel es otra de las técnicas para la separación de proteínas,esta se basa en el desplazamiento de las proteínas cargadas en un campo eléctrico.1 Los geles más usados, poliacrilamida (PAGE) y agarosa, tienen poros de dimensiones moleculares cuyos tamaños pueden especificarse. Por ello, las separaciones moleculares se basan en la filtración en geles y en las movilidades electroforéticas de las moléculas que se intenta separar. Los geles utilizados retardan lasmoléculas grandes en comparación con las de menor tamaño. Dado que las moléculas de una muestra no pueden abandonar el gel, el movimiento electroforético de las más grandes se ve impedido en comparación con el de las más pequeñas.2
Los geles utilizados en la práctica fueron: para la electroforesis “vertical”, gel SDS-PAGE al 12% y para la electroforesis “horizontal”, gel agarosa al 2% para lamedición de DNA y al 0.8% para RNA.
Para la determinación de las concentraciones los cálculos fueron realizados a través del método de Bradford, el que utiliza un colorante llamado azul brillante de coomasie G-250, que al unirse a una proteína, este es capaz de absorver a 595 nm. En el caso de las proteínas, fue usado el espectrofotómetro midiendo la absorbancia a una longitud de onda de 595 nm,para DNA y RNA se midieron las absorbancias a 260 y 280 nm.





II. Objetivos
- Separación de muestra de proteínas y muestra de ácidos nucleicos a través de electroforesis en gel.
- Determinar concentración de proteínas y ácidos nucleicos por método de Bradford.

III. Materiales y métodos
Hígado de Rata
Recipiente con hielo
Mortero
Tampón Tris-HCl 0,1 M pH 8
Muestras de ADN y ARNReactivo de Bradford
Cubetas para espectrofotómetro de plástico y de cuarzo
Espectrofotómetro
Tubos Eppendorf
Tubo Falcon
Centrifuga Hermle Z300K
Buffer de Carga 4X
Gel de Poliacrilamida al 12%
Fuente de poder para electroforesis
Azul de Coomasie
Gel de Agarosa al 2%
Gel de Agarosa al 0,8%

Primera Parte: Obtención del extracto clarificado
Utilizar el mortero para triturar el trozode hígado de rata. Luego agregar el triturado a un tubo Falcon con tampón Tris-HCl frío, y centrifugar a 1500g por 10 minutos a 4°C. Transferir el sobrenadante a un tubo Eppendorf y mantener en un recipiente con hielo hasta su utilización.
Segunda Parte: Medir la concentración de proteínas
Utilizar el método de Bradford para determinar la concentración de proteínas en el extracto clarificado. Seutilizará la curva de calibrado obtenida en el laboratorio 2. Se toman 2 µL del extracto clarificado y agregan 18 µL de agua destilada. Se toman 2 µL de esta solución y se agregan a una cubeta con 1,5 mL de Reactivo de Bradford y 48 µL de agua. Incubar las cubetas a temperatura ambiente por 10 minutos y medir la absorbancia a 595 nm.
Tercera Parte: Electroforesis de Proteínas
Mezclar 30 µL delextracto clarificado con 10 µL de Buffer de Transferencia 4X. Incubar la mezcla por 5 minutos a 100°C. Agregar a cada carril del gel de poliacrilamida al 12% las cantidades indicadas en la Tabla 1. Correr la electroforesis a un voltaje adecuado para la separación de las proteínas. Desmontar el aparato, extraer el gel y teñirlo con Azul de Coomasie para la visualización de las proteínas.
Tabla...