Elisa

ELISA de avidez

Shalóm Fabián fabianshalom@hotmail.com

1. Introducción
2. Objetivos
3. Procedimientos
4. Resultados
5. Conclusiones

Introducción
La interacción entre antígeno y anticuerpo se estabiliza mediante enlaces débiles, como puentes de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, interacciones electrostáticas e hidrofóbicas. La suma de todos estos enlacesgenera una interacción estable entre el lugar de unión del anticuerpo (parátope) y el lugar de unión del antígeno (epítope). Estas fuerzas son inversamente proporcionales a una potencia de la distancia entre los grupos interactuantes, lo que implica que epítope y paratope deben presentar estructuras complementarias para obtener una energía de unión suficiente como para resistir la disrupcióntermodinámica. La suma de estas fuerzas de atracción y de repulsión se conoce como afinidad del anticuerpo.
La avidez o avidez funcional representa la fuerza neta de unión de poblaciones de anticuerpos y es determinada por la afinidad que depende también de otras propiedades que son independientes de la reacción de unión primaria. Los anticuerpos son moléculas multivalentes en su interacción con elantígeno, es decir las moléculas de inmunoglobulina presentan un máximo de 10 (IgM) y un mínimo de 2 sitios de unión con el antígeno. Esta interacción multivalente entre antígeno y anticuerpo permite es una de las propiedades principales que tiene influye sobre la avidez de una población de anticuerpos.
Especificidad y reacción cruzada
La complementariedad existente entre epítope y paratopecondiciona la relación específica entre antígeno y anticuerpo. En general los anticuerpos son altamente específicos, siendo capaces de “discernir” entre pequeñas variaciones del antígeno, tanto a nivel de estructura primaria como de conformación estérica o configuración óptica del mismo.
Los anticuerpos con capacidad para unirse a epitopes estructuralmente relacionados (determinantesdiferentes reconocidos por el mismo anticuerpo) se denominan polifuncionales, y dan lugar a reacciones cruzadas de tipo I, mientras que el termino multiespecífico se utiliza para anticuerpos con reactividad frente a antígenos muy diferentes que comparten epitopes (reactividad cruzada de tipo II).
Métodos directos e indirectos
Métodos directos
Los métodos directos consisten en que el primeranticuerpo o anticuerpo primario se encuentra unido a algún tipo de marcador que permite identificar los lugares de la preparación donde se ha unido. Este método requiere un marcaje del anticuerpo primario, para lo que es necesario disponer de una cantidad importante (aprox. 1mg). Tiene como ventaja que sobre una misma preparación se pueden incubar tantos anticuerpos como se desee, o tantos comosistemas de marcaje diferentes podamos emplear. En el caso de la inmunofluorescencia el límite de marcadores simultáneos estará fijado por el número de juegos de filtros discriminantes entre fluorocromos que tengamos.

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Métodos indirectos
Se basan en la aplicación de un anticuerpo primario sobre el tejido que es reconocido por un segundo anticuerpo, secundario, contra la región Fcdel primario, unido a un marcador. El anticuerpo secundario se aplica a una concentración en exceso. Estos métodos son mucho más sensibles que los directos pues al anticuerpo primario se pueden unir más de un anticuerpo secundario, incrementando la señal. Otra ventaja de estos métodos es que basta con disponer de unos pocos secundarios marcados para poder reconocer un gran número de anticuerposprimarios diferentes.

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El marcaje del anticuerpo secundario es más fácil pues al obtenerse contra las inmunoglobulinas de una especie se dispone de gran cantidad de antígeno puro y se suelen inmunizar animales grandes (cabra, oveja, caballo, etcétera) con lo que se dispone de gran cantidad de anticuerpo para la reacción. El límite en el número de antígenos que es posible detectar...