Elisa
Páginas: 2 (277 palabras)
Publicado: 6 de mayo de 2014
ELISA
Unión del antígeno
Lo primero es fijar el antígeno durante al menos 2 horas con agitación (también o/n a 4ºC).
Se añaden 50 μl/pocillo del antígenodiluido a la concentración deseada en PBS. El control negativo se hace con BSA para ver la especificidad del anticuerpo.
Solución de bloqueo (leche para el ELISA)
Elantígeno se retira con el programa el lavador de ELISA programa del lavador ASPIRATION.
Se añade 180 μl de PBS + 3% leche.
Se mantiene durante al menos 2 horas enagitación leve.
Adición del anticuerpo primario
Se aspira el BSA + leche con el lavador de ELISA ASPIRATION.
Se añade 50 μl del anticuerpo primario con la dilucióncorrecta en PBS + 3% leche a cada pocillo.
Se espera 1 hora dejando la placa en agitación leve.
Adición del anticuerpo secundario
En el lavador de ELISA se hacen 3lavados con PBS programa del lavador 3W0.5+A
Se añade 50 μl del anticuerpo secundario con la dilución correcta en PBS + 3% leche a cada pocllo.
Se espera 1-2 horas,con la placa en agitación leve.
Solución de revelado con peroxidasa
En el lavador de ELISA se hacen 3 lavados con PBS 3W0.5+A
Se prepara la mezcla
25 ml deBuffer Fosfato-Citrato pH 5,0
25,7 ml HNa2PO4 0,2 M
24,3 ml ácido cítrico 0,1 M
50 ml de H2O. Ajustar a pH 5 si es necesario
Añadir una pastilla de OPD de 10 mg
10μl de peróxido de hidrógeno 30%
Se añade 80 μl de mezcla a cada pocillo.
Se incuba 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad.
Se detiene la reacción con 20 μl deHCl 3 M por pocillo y se lee la absorbancia a 492 nm.
NOTA: El lavador de ELISA se limpia 2 veces con PRIME/RINSE antes y después de poner cualquier programa.
Unión del antígeno
Lo primero es fijar el antígeno durante al menos 2 horas con agitación (también o/n a 4ºC).
Se añaden 50 μl/pocillo del antígenodiluido a la concentración deseada en PBS. El control negativo se hace con BSA para ver la especificidad del anticuerpo.
Solución de bloqueo (leche para el ELISA)
Elantígeno se retira con el programa el lavador de ELISA programa del lavador ASPIRATION.
Se añade 180 μl de PBS + 3% leche.
Se mantiene durante al menos 2 horas enagitación leve.
Adición del anticuerpo primario
Se aspira el BSA + leche con el lavador de ELISA ASPIRATION.
Se añade 50 μl del anticuerpo primario con la dilucióncorrecta en PBS + 3% leche a cada pocillo.
Se espera 1 hora dejando la placa en agitación leve.
Adición del anticuerpo secundario
En el lavador de ELISA se hacen 3lavados con PBS programa del lavador 3W0.5+A
Se añade 50 μl del anticuerpo secundario con la dilución correcta en PBS + 3% leche a cada pocllo.
Se espera 1-2 horas,con la placa en agitación leve.
Solución de revelado con peroxidasa
En el lavador de ELISA se hacen 3 lavados con PBS 3W0.5+A
Se prepara la mezcla
25 ml deBuffer Fosfato-Citrato pH 5,0
25,7 ml HNa2PO4 0,2 M
24,3 ml ácido cítrico 0,1 M
50 ml de H2O. Ajustar a pH 5 si es necesario
Añadir una pastilla de OPD de 10 mg
10μl de peróxido de hidrógeno 30%
Se añade 80 μl de mezcla a cada pocillo.
Se incuba 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad.
Se detiene la reacción con 20 μl deHCl 3 M por pocillo y se lee la absorbancia a 492 nm.
NOTA: El lavador de ELISA se limpia 2 veces con PRIME/RINSE antes y después de poner cualquier programa.
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