Ensayo Precipitación Por Sales De Proteínas Del Suero. Desalinización De Soluciones De Proteínas Por Filtración En Gel. Determinación De concEntración De Proteínas.”

Pontificia Universidad Católica de Valparaíso

Instituto de Química

Bioquímica





Informe Laboratorio N°5:

“Precipitación por sales de proteínas del suero. Desalinización de soluciones de proteínas por filtración en gel. Determinación de concentración de proteínas.”

Bioquímica experimental I

BQA 345







-Profesora: Raquel Araya A.
-Ayudante: DiegoDíaz.
-Integrantes: Ornella Realini F.
Paula Suazo B.
-Fecha: 6 de Mayo de 2011.
1. INTRODUCCIÓN

La solubilidad de las proteínas depende de gran medida de la concentración salina (fuerza iónica) del medio. Las proteínas, por lo general, se disuelven mal en el agua pura, pero su solubilidad aumenta al incrementar la fuerza iónica porque los iones inorgánicos bien hidratdos se unen cada vezmás a la superficie de la proteína e impiden la agregación de las moléculas (“salting in” o disolución). Cuando se tienen valores muy altos de fuerza iónica la forma salina de las proteínas elimina el agua de hidratación y produce la agregación y precipitación de las moléculas (“salting out” o precipitación). Por esta razón, el agregado de sal que se utilizará en este laboratorio, sulfato deamonio (NH4)2SO4 permite fraccionar las proteínas de una mezcla de acuerdo con su solubilidad (fraccionamiento).

La técnica que es capaz de separar los componentes de una mezcla, adicionando este agregado de sal, es la centrifugación. La centrifugación es una técnica de separación que se basa en el movimiento de partículas impulsadas por la fuerza centrífuga, la cual tiende a desplazar estaspartículas lejos del centro de rotación. Esta técnica separa las partículas de una especie según su masa y su forma. Su principal aplicación consiste en separar las células sanguíneas del plasma o suero, para obtener sedimentos para su posterior estudio, y para separar precipitados y fases en las extracciones con disolventes orgánicos.

Una vez obtenido los sobrenadantes y los precipitadoscorrespondientes de una mezcla, la cromatografía se encargará de separar sus componentes. La cromatografía es un método de separación en el cual los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una que permanece inmóvil (fase estacionaria) mientras que la otra (fase móvil) se mueve en una dirección determinada a través de la primera. El diferente reparto de solutos entre las fases móvil yestacionaria es la causa de la separación de los solutos. Existen distintos tipos de cromatografía pero, para el interés de este laboratorio, se utilizará la cromatografía de exclusión molecular. En la cromatografía de exclusión molecular se separa a las moléculas por su tamaño. La fase móvil liquida pasa a través del gel poroso, siendo los poros lo bastante pequeños para excluir a los solutos grandes,pero no a los pequeños. Las moléculas grandes no pueden penetrar el gel pero las pequeñas si lo hacen, debiendo atravesar más volumen para abandonar la columna.

Para la posterior cuantificación de proteínas en una muestra, se puede utilizar el método de Bradford. Este método cuantifica la unión de un colorante a una proteína desconocida, y la compara contra diferentes cantidades de unaproteína estándar. El complejo que aquí se forma presenta un máximo de absorción a 595 nm. Este método es simple, confiable, rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinación.

De esta forma, será posible determinar el fraccionamiento de proteínas de una muestra de sangre humana por precipitación por sales.



2. OBJETIVOS

- Centrifugar la solución de proteínas consulfato de amonio, para obtener sobrenadantes y precipitados.

- Construir y montar una columna cromatográfica de exclusión molecular para desanilizar las soluciones obtenidas.

- Separar los componentes de una mezcla de proteínas utilizando la cromatografía de exclusión.

- Medir las absorbancias de las fracciones obtenidas utilizando método de Bradford.

- Determinar las...