Determinacion de proteinas en suero

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RAHUL RACHWANI 09/11/09
1º MEDICINA: BIOQUÍMICA
Práctica 4: Análisis bioquímico de las proteínas del suero. Determinación de proteínas en suero mediante la reacción de Biuret.

1. Fundamento de la fotometría de absorción y el Reactivo de Biuret
La fotometría por absorción es un método de análisis de composición química basado en la medición de la atenuaciónde la radiación electromagnética como consecuencia de la absorción que se produce en su interacción con la solución, es decir, se ilumina una solución con determinado tipo espectral de luz (blanca de 5500 Kº, ultravioleta, infrarroja) y se determina su composición a partir del índice de absorción de la luz original. Tiene la ventaja de no alterar la solución analizada, ya que sólo se limita ailuminarla sin excitarla.
Para explicar la fotometría de absorción, insinuaremos a un ejemplo:
Así, si tenemos una muestra de sangre en un tubo de ensayo y lo sometemos a centrifugación, obtendremos en la parte baja del tubo, precipitado, los glóbulos rojos, y en la parte alta, el plasma, es decir, el agua y las proteínas.
Para determinar si hay proteínas, teñiremos la muestra con un reactivo, queen caso afirmativo se teñirá de azul.
Para cuantificar ahora la cantidad de proteínas que tenemos que medir la intensidad del color tras reaccionar la muestra con el reactivo. Es aquí donde interviene la fotometría de absorción. Utilizaremos un espectrofotómetro para cuantificar la absorción de luz.
El reactivo que utilizaremos es el reactivo de Biuret (RB).
El Reactivo de Biuret es aquel quedetecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida.
Está formado por hidróxido sódico 1M (NaOH), tartrato de sodio y potasio (KNaC4O6·4H2O) 16mM, Ioduro potásico (KI) 16mM y Sulfato cúprico (CuSO4) 6mM. El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combinacon polipéptidos de cadena corta. El Hidróxido de Sodio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar.
La intensidad del color está relacionada con la concentración de proteínas presente en la muestra estudiada y el color es debido a la formación de un complejo tetravalente entre el átomo de cobre (Cu++) y el nitrógeno perteneciente al enlacepeptídico.
Esta reacción, por ello, lo presentan todas las sustancias que contienen dos grupos C=O-NH2 o que presentan dos o más uniones peptídicas.

Normalmente se utiliza un filtro delante del tubo de ensayo que contiene la muestra, para seleccionar la longitud de onda (λ). En el caso de determinación de proteínas, la longitud de onda (λ) que seleccionaremos es de 560nm.------------I0------------> ---> ------------> It
Espectrofotómetro Filtro (λ=560nm) (Ia: intensidad absorbida) Tubo de ensayo con sangre.
Debemos conocer unos conceptos básicos en la fotometría de absorción:
Io: intensidad inicial del rayo monocromático que incide sobre la solución coloreada, es decir, la luz emitida que va a incidir sobre la sustancia que estamos estudiando.
It: intensidad del rayotransmitida
Ir: intensidad del rayo reflejada
Ia: intensidad del rayo absorbida
Así, podemos establecer que:
Io = It + Ia + Ir
Puesto que cuando el rayo incide perpendicularmente Ir = 0;
Io = It + Ia
Definimos transmisión como la cantidad de luz que es recogida tras atravesar la solución y se expresa como:
T = It / Io
También podemos expresarlo en porcentaje multiplicándolo por 100.
Al inverso dela transmisión, se denomina opacidad (O)
O = 1/T
Lambert y Beer determinaron que la relación existente entre el rayo incidente sobre la solución y el rayo transmitido dependía del espesor que tenía que atravesar el haz de luz, la naturaleza de la sustancia que atraviesa y de la concentración de dicha sustancia en la solución.
Así determinaron:
T = 10 –E x c
E: coeficiente de extinción molar,...
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