Enzimas de restriccion

Universidad Nacional Autónoma de México

Bioquímica Experimental 0141

ENZIMAS DE RESTRICCION-Bioquímica Experimental.

1. Se mandó sintetizar un oligonucleótido al Instituto de Fisiología Celular de la UNAM. El producto entregado por esta institución se encontraba en disolución en un tubo eppendorf con 100 (l. Se midió la A260 de una muestra diluida 1:100 cuyo valor fue de 0.665.
a)¿Qué concentración tiene la muestra original?

1 unidad de absorbancia a 260 nm – 50 µg/mL de DNA de doble cadena
0.665 unidades de absorbancia a 260 nm – x

x= 33.25 µg/mL

33.25 µg/mL = 0.03325 µg/µL

C2= 0.03325 µg/µL
V2= 100 µL
V1 = 1 µL

C1 = (0.03325 µg/µL)(100 µL) = 3.325 µg/µL
1 µL

b) ¿Qué cantidad total de oligonucleótido sintetizó el IFC?(3.325 µg/µL) (100 µL) = 332.5 µg

2. Posteriormente se requería nuevamente otro oligonucleótido, sin embargo esta vez se decidió mandarlo sintetizar con Sigma quien entregó el producto en forma liofilizada con la siguiente información:

|Oligo Name |Length |MW |Tm |nmol |%GC |
|Silicat-4|27 |8333.3 |70.4 |32.6 |51.85 |

a) ¿Cuánto volumen de buffer necesitarías adicionarle al liofilizado para obtener una concentración de 100 (M?
32.6 nmol = 0.0326 µmol

100 µmol – 1000 mL
0.0326 µmol – x

x= 0.326 mL = 326 µL

b) ¿A cuanto equivaldría la concentración de 100 (M expresada en (g/ml?[pic]

3. Se realizó la clonación del gene de la osteopontina humana en el vector pRSET-A utilizando el sitio de reconocimiento de la enzima BamHI. Debido a que se utilizó un sitio de restricción único, hay 50% de probabilidad de que el gene se inserte en la dirección 5’-3’ o 3’-5’. Sin embargo debido a la orientación de las secuencias regulatorias de la expresión en el vector, para que laproteína sea expresada el gen debe quedar insertado en la dirección 5’-3’. Como podrías descartar a las clonas que no cumplen con este requisito?
a) ¿Qué enzimas de restricción te permitirían inequívocamente decidir de que construcción se trata?
b) ¿Cual sería el patrón de restricción en cada una de las orientaciones? No importa si no das el tamaño exacto de los distintos fragmentos pero si unaproximado.

Posterior a la digestión de pRSET-A con BamHI el gen se observaría así:

Si es gen osteopontina se digiere con NdeI se obtienen los siguientes fragmentos:

Si es gen osteopontina se digiere con EcoRI se obtienen los siguientes fragmentos:

Posibilidades de inserción del gen de osteopontina humana:

Inserción correcta

Inserción incorrecta

a)Utilizando la enzima de restricción NdeI se puede comprobar que la inserción del fue correcta, por que al tratar el plásmido con la correcta inserción, se obtendrían dos fragmentos, uno de aproximadamente 3100 pb y uno de 500 pb; mientras que al tratar el plásmido con la inserción del gen incorrecta, se obtendrían dos fragmentos, uno de aproximadamente 2600 pb y otro de 1000 pb.

b)

Sila inserción es correcta se obtiene un fragmento de 3179 pb y otro de 571pb.

Si la inserción es incorrecta se obtiene un fragmento de 2679 pb y otro de 1071pb.

4. Se desea expresar en forma recombinante en E.coli, la alquil sulfatasa SdsA1 de P.aeruginosa.En pseudomonas esta proteina se encuentra en el espacio periplasmico y se sabe que es un homo tetrámero. Además su secuenciaprimaria tiene las siguientes características:
no. Aminoácidos = 655por monómero
Peso molecular = 72.5kDa por monómero
pI = 4.5

Diseña una estrategia de expresión recombinante para esta proteína.
Responde al menos las siguientes preguntas:
¿En que vector clonarías la secuencia codificante de la SdsA1 para su expresión recombinante en E.coli y por que?
¿Qué medio...