Enzimas

Memorias del XIV Congreso de Bioenergética y Biomembranas. Sociedad Mexicana de Bioquímica A.C. 13 al 18 noviembre 2005; Oaxaca, Oaxaca.

INACTIVACIÓN TÉRMICA DE LA GLUCOSA OXIDASA DE Aspergillus niger Paz-Alfaro K.J., Ruiz-Granados Y.G., Nájera-Peña H. y Sampedro J.G. Área Académica de Nutrición. Instituto de Ciencias de la Salud. Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo. Abasolo 600, col.Centro. CP 4200. Pachuca, Hidalgo. México. Tel. 01(771)7172000 ext. 5114. CE: jg.sampedro@gmail.com INTRODUCCIÓN La muerte celular por estrés se sabe está relacionada a la desnaturalización proteica. Algunos organismos han desarrollado una serie de mecanismos que le permiten vivir en estas condiciones adversas (1). La respuesta general al estrés incluye la síntesis de algunas enzimas antioxidantes,proteínas de choque térmico (hsp) y la acumulación de solutos compatibles (2). Los solutos compatibles son pequeñas moléculas que se acumulan en el citoplasma en diferentes condiciones de estrés. La trehalosa, glicina betaína, manosil glicerato y el glicerol se acumulan en organismos tan variados como, las bacterias, levaduras, plantas y crustaceos (1). En este sentido se ha demostrado que latrehalosa es capaz de estabilizar a las proteínas contra el daño ocasionado por temperatura, deshidratación, presión y radicales libres (3). La estabilización de enzimas por trehalosa resulta en una disminución en la constante de velocidad de la inactivación y en la kcat (4,5). Por lo que se observa una dependencia directa de estas constantes de velocidad con la viscosidad del medio (5). Por loanterior se propuso que toda reacción en proteínas que contenga un componente difusivo sería inhibida por un aumento en la viscosidad del medio de acuerdo a la teoría de Kramers (5). La enzima glucosa oxidasa (GOD) de Aspergillus níger es un homodimero con un peso molecular de 160 kDa y se encuentra altamente glicosilada (16% peso/peso) (6). La GOD contiene dos grupo prostéticos de FAD, los cualesestán fuertemente pero no covalentemente unidos. El FAD participa en la reacción de oxidación-reducción (glucosa + O2→δgluconolactona) que lleva a cabo la enzima. La glucosa oxidasa es una enzima que presenta una alta resistencia a la desnaturalización; se sabe que la

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inactivación térmica se debe principalmente la liberación del FAD (7). El objetivo del trabajo es estudiar el efecto de latrehalosa en la inactivación térmica de la GOD. MATERIALES Y MÉTODOS Reactivos: los reactivos utilizados para los diferentes experimentos incluyendo la GOD, fueron adquiridos de Sigma Chemical Co. Purificación de la glucosa oxidasa. La GOD (Sigma Chemical Co.) fue purificada por cromatografía en columna (Sephacryl 200HR). La GOD se cargó en la columna y se eluyó con EGTA 1 mM en amortiguador defosfatos 20 mM (pH 7.0) a una velocidad de flujo de 10ml/hr. Se colectaron fracciones de 1 ml y se midió la absorbencia a 280 nm. Posteriormente, se determinó la concentración de proteína (método de Lowry, con BSA como estándar) en las fracciones del pico máximo. La pureza de las fracciones se evaluó por SDSPAGE. Para los experimentos de inactivación térmica se empleó la fracción más pura. Efecto de lapresencia de trehalosa en la cinética de la GOD. La cinética de saturación de la GOD fue determinada colorimetricamente empleando un sistema acoplado peroxidasa/o-dianisidina a 30ºC: 3 ml vol. final conteniendo o-dianisidina (0.1 ml de o-dianisidina al 1% en 12 ml de amortiguador de fosfato de potasio 0.1 M pH 6.5; saturado con oxígeno,) peroxidasa (6.6 µg/ml) y diferentes concentraciones deglucosa. La mezcla de reacción se preincubó por 10 min a 30º C, posteriormente la reacción se inició agregando 20µl de GOD (1.57 µg de prot.). El aumento de la absorbencia a 460 nm se siguió por 4 min y de la pendiente de la línea formada se calculó la velocidad de catálisis. El efecto de la trehalosa sobre la actividad de la GOD se determinó incluyendo diferentes concentraciones de trehalosa (M:...