Extraccion de adn, practica

PRACTICA NUMERO 1; EXTRACCION DE ADN
-OBJETIVO:
El objetivo de esta práctica es saber y comprender cuál es, y como se lleva a cabo la extracción del ADN de un tejido vegetan, para así llegar a su visualización y con esto poder entender su organización.
-INTRODUCCION:
El ADN (Ácido desoxirribonucleico) se puede definir como:
Molécula que contiene la información genética que define a todoser vivo y que es responsable de la transferencia de dicha información de generación en generación. Cada molécula de ADN está formada por dos cadenas de moléculas específicas que forman una doble hélice. Este ADN está compuesto de azúcares, fosfatos, y cuatro bases nucleótidas: adenina, guanina, citosina y timina (A, G, C, T). Las bases se unen en pares específicos.
El aislamiento de lamolécula de ADN se realizó por primera vez en 1869, a partir de núcleos aislados de linfocitos humanos y se denominó "nucleina".
En 1985, Mullis reunió algunas de las metodo-logías desarrolladas durante varios años, para realizar síntesis de ADN in vitro en forma exponencial, denominando este método reacción de polimerasa en cadena (en inglés Polymerase Chain Reaction: PCR). Esta metodología esconsiderada como una revolución dentro la biología molecular ya que con la amplificación exponencial es posible el análisis de moléculas de ADN o ARN, a partir de mínimas cantidades de muestras.
La extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas como son: En primer lugar tiene que romperse la pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula. A continuación deberomperse también la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Los jabones utilizados como lavavajillas emulsionan los lípidos de las membranas celulares y las rompen. Para aislar el ADN hay que hacer que precipite en alcohol. El ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interfase entre el alcohol y el agua.Además de permitirnos ver el ADN, el alcoholsepara el ADN de otros componentes celulares, los cuales son dejados en la solución acuosa.

-Material :
 Tubos de Eppendorf de 1.5 ml (microtubo de polipropileno de alta transparencia color natural, tapón unido al tubo. Resistencia a la centrifugación: 14.000 rpm. Congelables hasta -100ºC)


 Piston de plastico (para moler la muestra en el tubo eppendorf)
 Micropipetas manual de 500µl, 200µl.



 Micro centrifuador (Una microcentrifuga es una centrífuga de muy reducidas dimensiones diseñada para la centrifugación de tubos y viales pequeños. Con la centrifugación se consigue separar los elementos sólidos dispersos en el líquido. La separación se basa en las distintas velocidades de rotación de los elementos sólidos y líquidos.)


-Reactivos
 Buffer de extracción (urea, NaCl 300mM, Tris-HCl 50 mM Ph 8.0, EDTA 20 mM Ph 8.0, sarcosina 2.0 %)
 Fenol

-Procedimiento
1. Moler el tejido congelado en un tubo de eppendorf .
Ya que se congelo la muestra del tejido vegetal (muestra de parte de la hoja de planta chi) a -80 °C se procede a triturarla en el tubo de eppendorf con un pistilo de plástico para comenzar a romper las células de la hoja y se inicie laliberación de todas las moléculas junto con el ADN.
2. Agregar 200 µl de buffer de extracción ( urea, NaCl 300mM, Tris-HCl 50 mM Ph 8.0, EDTA 20 mM Ph 8.0, sarcosina 2.0 %)
3. Mezclar perfectamente el tejido vegetal con el buffer de extracción .
Se agita la mezcla para que así el buffer penetre en las células y comience a actuar.
4. Agregar a la mezcla 200 µl de fenol y 200 µl de cloroformo,homogenizar perfectamente y centrifugar 5 minutos a 13 000 rpm.
Al agregar el fenol y el cloroformo se debe mezclar y agitar el tubo con la muestra para lograr la homogenización, esto propicia la eliminación de las proteínas presentes, después, se pasan los tubos con las muestras a la microcentrifuga para activarla durante 5 min a 13 000 rpm, al centrifugar la muestra se obtienen 2 fases,...