Extraccion de rna

|.EXTRAÇÃO DE RNA ( TRIZOL ) |


1. NUNCA utilizar mais de 100 mg de tecido em 1 ml de Trizol


2. Colocar 1 ml de Trizol por amostra (eppendorf livre DNAse/ RNAse)


3. Trituração dos tecidos por moagem (martelo) sob baixa temperatura – nitrogênio líquido4. Colocar 200 (l de clorofórmio – agitar vigorosamente por 15 segundos. Depois passar no vórtex. Não pode molhar o filtro da ponteira para evitar contaminação. DICA: Colocar o clorofórmio de 4 em 4 amostras e agitá-las logo após a adição.


5. Incubar por 3 min a temperatura ambiente.


6. Centrifugar 12000g 15 min 4ºC.


7. Transferir a fase aquosa para um tubo novo.Aspirar CUIDADOSAMENTE com a ponteira no menisco. Pegar 500 a 550 (l para evitar contaminação da fase fenólica. CUIDADO PARA NÃO MOLHAR O FILTRO, EVITAR CONTAMINAÇÃO.


8. Colocar 500 (l de isopropanol e agitar por inversão (auxílio de outra grade) – precipita RNA.


9. Incubar 10 min a temperatura ambiente.


10. Centrifugar 12000g 10 min 4ºC.


11. Remover o sobrenadante porinversão e secar a boca do tubo em papel.


12. Colocar 950 (l de etanol 75% (em água + DEPC = Observar que o frasco de álcool é 95%, ou seja, para 25 ml de solução 75%, serão necessários ~20 ml de álcool) ( NÃO SE PREOCUPAR EM DISSOLVER O PELLET.


13. Agitar no vórtex.


14. Centrifugar 7400g 5 min 4ºC.


15. Remover o sobrenadante por inversão, secar a boca do tubo em papel esecar o pellet no ar ou a vácuo (CUIDADO QUE O PELLET SOLTA COM FACILIDADE). ( Aguardar aproximadamente 2 horas quando secando à temperatura ambiente.


16. A PARTIR DESTA ETAPA, MANTER SEMPRE EM GELO. Ressuspender os pellets em 15 a 20 (l de água +DEPC. Se for guardar, conservar a -20ºC.


17. Incubar 10 min 55ºC a 60ºC se o passo 16 não for suficiente.






Quantificaçãode RNA


Diluir o RNA em água + DEPC (cerca de 70 vezes, dependendo da concentração de RNA. Ler em espectrofotômetro a 260 nm. Calcular ou anotar a razão 260/280 – esta deve ficar entre 1.3 e 2).


1(l da amostra + 69 (l água DEPC ( Na cubeta usar os 70 (l para quantificação do RNA).


Configurações do Espectrofotômetro GeneQuant do Prof. Fernando Cunha:


1. Clicar nobotão RNA


2. Setup (apertar Enter para mudar de campo)


a. Dilution factor: 70


b. Pathlenght: 10 mm


c. Units: (g/(l


d. Use 320nm: NO


3. Colocar o Branco (H2O + DEPC) na cubeta e inserir no equipamento


4. Clicar set ref (aguardar leitura do Branco = 0)


5. Apertar Enter após colocar as amostras


6. Desligar oequipamento.





|TRATAMENTO COM DNase (AMP. GRADE) |


Essas concentrações se referem a 2(g de RNA (CASO NÃO SEJA FEITO O –RT-PCR, CALCULAR PARA 1(g de RNA E DIVIDIR TUDO ABAIXO PELA METADE). Ajustar esses valores para o número total de amostras. Neste momento deve-se lembrarque daqui será feito o –RT-PCR e o RT-PCR (o –RT-PCR não é essencial; analisar cada caso).


Caso as amostras forem retiradas da geladeira dar um spin (centrifuga).






Irá utilizar 2(g de RNA para fazer a análise, precisa corrigir os volumes.


Exemplo: na leitura do aparelho a concentração foi 4,318 (g/ (l


4,318(g ............1 (l


2,0 (g ............ xx = 0,46 (L


No caso utilizará 0,46 (L da amostra + 7,54(L dando um total de 8 (L. Fazer isso com todas as amostras com os valores das concentrações dadas no espectrofotômetro.






1. MIX 01 (12(L / amostra) – Preparar 2-3 reações a mais do que o total.


-2(L Buffer DNase


-2(L enzima DNase


-8(L água + DEPC






2. Adicionar em...