PROTOCOLO EXTRACCIÓN RNA

PROTOCOLO EXTRACCIÓN RNA (MÉTODO CTAB).


1) Pesar 6 gr de tejido congelado con anterioridad en nitrógeno líquido.
2) Moler tejido con nitrógeno líquido agregando PVPP (punta de espátula).
3)Rápidamente añadir el homogenizado a 10 ml de Buffer CTAB. (el CTAB debe estar a 65 °C y antes de usar agregar 2% de -Mercaptoetanol). Mezclar en vortex.
4) Incubar a 65 °C durante 15 minutos.
5) Adicionarigual volumen de Cloroformo/Alcohol isoamílico 24:1 (10 ml) y centrifugar a 10.000 rpm por 25 minutos (4 °C)
6) Recuperar el sobrenadante y adicionar nuevamente igual volumen de Cloroformo/Alcoholisoamílico 24:1 (10 ml). Centrifugar a 10.000 rpm por 25 minutos. (4 °C)
7) Recuperar el sobrenadante. Adicionar ¼ del volumen recuperado con LiCl 10M (2.5 ml). Mezclar suavemente por inversión yprecipitar durante toda la noche a 4 °C. (alternativamente precipitar RNA durante 4 horas a –80 °C).
8) Centrifugar a 10.000 rpm por 25 minutos (4 °C), eliminar sobrenadante.
9) Disolver el pellet en 500 lde Buffer SSTE. (En esta etapa comenzar a trabajar en hielo).
10) Transferir los 500 l de Buffer SSTE-RNA a tubos eppendorf de 1.5 ml de capacidad y adicionar igual volumen de Cloroformo/Alcoholisoamílico 24:1 (500 l). Homogenizar suavemente por inversión.
11) Centrifugar a 10.000 rpm por 20 minutos. (25 °C).
12) Recuperar el sobrenadante y agregar igual volumen de Etanol absoluto (-20 °C).Mezclar suavemente por inversión y precipitar a –80 °C durante 30 minutos.
13) Centrifugar a 12.000 rmp por 10 minutos (25 °C). Eliminar el sobrenadante y secar a temperatura ambiente.
14) Resuspenderel pellet en 50 l de agua-DEPC (más o menos según el pellet obtenido disolviendo cuidadosamente el pellet obtenido).

Nota: Todas las soluciones se preparan con Agua DEPC.

1) Buffer Extracción:
2%CTAB (Hexadecyltrimethylammonium bromide)
2% PVP (Polyvinylpirrolydone K40)
100 mM Tris -HCl pH 8.0
25 mM EDTA
2.0 M NaCl

Ajustar volumen con Agua DEPC.
Mezclar y autoclavar.
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