Extracion De Adn

1. Describa y fundamente algunos de los métodos comunes de extracción de ADN (Salting Out, fenol –cloroformo, cromatograficos, ebullición o Boiling, etc.)

SALTING OUT:

Es un Método de purificación que utiliza la reducción de la solubilidad de ciertas moléculas in una solución de muy alta concentración iónica. En este método se utiliza un buffer que contiene Tris- HCL, PH 8.3, Proteinasa K;la cual destruye las membranas nucleares, liberando a la solución los ácidos nucleicos. El siguiente paso consiste en la precipitación de los ácidos nucleicos, ya que el DNA presentes en soluciones con alta concentración de sales como el acetato de sodio (AcONa) puede precipitarse mediante la adición de alcohol etílico a dichas soluciones.

METODO FENOL – CLOROFORMO:

Este método deextracción de ADN al CTAB (Sal de amonio cuaternario) Permite obtener un ADN libre de proteínas y enzimas. El Fenol Diluye las Proteínas (el cloroformo diluye a su vez el fenol)Por ser de hidrófobas. Como los por su contenido en fosfato, son hidrófilos, van a diluirse en fase acuosa formándose estas dos fases Tras la centrifugación de la muestra.
Finalmente se la fase acuosa se pasa a otro tubo donde semezcla con etanol absoluto, lo cual da como resultado un precipitado el cual seria los ácidos nucleicos.

Proceso:
• Rotura de células: el cual se realiza agregándole unos componentes (CTAB 2%, Tris 0.2 M pH 8, EDTA 0.02 M pH8, NaCl 1.4 M, B mercaptoetanol 0.2%) proceso realizado con las basiloesporas se centrifuga y se toma en sobrenadante.

• Precipitación de proteínas: se añadefenol-cloroformo-alcohol isoamilico. Se toma la parte superior del micro tubo y se repite el proceso.

• Eliminación de fenol: se añade cloroformo y se toma la fase superior y se repite proceso.

• Precipitación de ácidos nucleicos: se agrega isopropanol i se incuba 1hora menos de 20°C.

• Lavado del precipitado: se elimina el sobrenadante y se lava con etanol 70%.



METODOS CROMATOGRAFICOS:Intercambio iónico: Es uno de los métodos más comunes para la separación directa de ácidos nucleicos. El mecanismo básico es el intercambio reversible de los iones en solución con los grupos funcionales unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina.

Por ejemplo:
un ácido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se unirá a un intercambiador iónico con grupos cargadospositivamente, pero efluirá de la columna al cambiar al pH del tampón (tampón de elución) ya que los iones del tampón de elución interaccionan con los grupos cargados del ácido nucleico o del intercambiador iónico, respectivamente; primero eluirán de la columna las moléculas cargadas positivamente que no se unen a la fase estacionaria y posteriormente, al añadir el tampón de elución, eluirán lasmoléculas con poca carga negativa neta y luego las de mayor carga negativa neta.


Adsorción: este método se basa en la adsorción y desorción de los ácidos nucleicos en presencia de sales cao trópicas. Los ácidos nucleicos están recubiertos de una capa hidratante de moléculas de agua que mantienen la solubilidad del DNA en soluciones acuosas. Con la adición de iones cao trópicos a los ácidosnucleicos, se destruye esta ordenada estructura de moléculas de agua de la capa hidratante, por lo que las sales cao trópicas crean un entorno hidrofóbico alrededor del DNA. Bajo estas condiciones hidrofóbicas, los ácidos nucleicos se unen perfectamente a la membrana de sílica de las columnas, mientras que las proteínas, los metabolitos y otros contaminantes no se unen y, por lo tanto, son eliminados dela muestra durante los pasos de lavado. Posteriormente, los ácidos nucleicos se eluyen de la membrana de sílica mediante tampones de elución con baja concentración de sales (ligeramente alcalinos) o simplemente agua, ya que permiten recuperar la capa hidratante de los ácidos nucleicos, liberándolos así de la membrana.

BOILING:

La extracción de plásmidos por calor (Met. Boiling o de...