Formiato Deshidrogenasa

HIPÓTESIS.
Si la síntesis de la formiato deshidrogenasa y nitrato reductasa en Escherichia coli aumenta en condiciones anaerobias que en aerobias entonces habrá una mayor actividad enzimática.
Si la formiato deshidrogenasa y nitrato reductasa de Escherichia coli requieren de oligoelementos como cofactores entonces en presencia de ellos habrá mayor actividad enzimática.
Si en presencia denitrato la formiato deshidrogenasa y nitrato reductasa aumentan su síntesis entonces habrá una mayor actividad enzimática.
DISEÑO EXPERIMENTAL.
Se obtuvieron cuatro cultivos de E. coli que se sometieron a diferentes condiciones de crecimiento:
1. Sin KNO3, con oligoelementos y en anaerobiosis.
2. Con KNO3, con oligoelementos y en anaerobiosis.
3. Con KNO3, sin oligoelementos y enanaerobiosis.
4. Con KNO3, con oligoelementos y en aerobiosis.
Todos los cultivos fueron incubados a 37°C en estado estacionario menos el que estuvo en aerobiosis que fue con agitación. Posteriormente se obtuvo la biomasa de cada cultivo, a os que se les adicionó regulador TMK-20 con la adición de sacarosa al 20% y 2 mg/mL de lisozima. Después se congelaron y calentaron estos paquetes hasta que seobservó una consistencia viscosa y se les adicionó un regulador con 10 μg/mL de DNasa, todo esto fue para obtener los extractos celulares.
Con estos extractos determinamos la actividad de formiato deshidrogenasa por medio de una técnica colorimétrica que va a medir la formación de nitritos a través de la formación de una cadena artificial de electrones, en donde a una celda de espectrofotómetro sele adicionó 2,6-DCPIP como aceptor final de electrones que al estar reducido es incoloro, formiato de sodio que actúa como donador de electrones para la formiato deshidrogenasa, metosulfato de fenazina que sirve como acarreador de los electrones entre la formiato deshidrogenasa y el 2,6-DCPIP, re gulador de fosfatos y extracto celular. Esta celda se leyó a una λ de 600 nm. a intervalos de 1 mindurante 10 min.
Para la determinar la actividad de nitrato reductasa en un frasco para suero agregamos KNO3 que sirve como sustrato de la enzima y como aceptor final de electrones, benzil viológeno que sirve como donador de electrones para la nitrato reductasa, regulador de fosfatos y extracto celular. Posteriormente se le pasó una corriente de N2 para crear las condiciones anaeróbicas después de15 min. De incubación a 45°C se le adicionó hidrosulfito de sodio que sirve como donador de electrones para el benzil viológeno. Finalmente se deja incubar durante 10 min. A 45°C y se destapa y agita para detener la reacción.
También se determinó la actividad del complejo formiato deshidrogenasa-nitrato reductasa en donde a un frasco para suero se le adicionó KNO3 como aceptor final de electronesde la cadena respiratoria, regulador de fosfatos y extracto celular, posteriormente se le pasa una corriente de N2 para producir condiciones anaerobias se tapó y se incubo a 37°C durante 5 min. Se le adicionó formiato de sodio como donador de electrones para la formiato deshidrogenasa y se volvió a incubar 10 min. A 37°C finalmente se destapó y agitó el frasco para detener la actividad.
Paracuantificar la cantidad de nitritos producidos por los dos experimentos anteriores a las muestras se le agregaron alícuotas de solución 3 que contiene N-naftil etilendiamina y sulfanilamida que reaccionan con el nitrito para formar p-sulfobenceno-azo-α-naftilamina que es un compuesto colorido, se dejó reaccionar durante 10 min. Y se leyó la absorbancia una λ de 520 nm.
Para determinar la cantidad deproteínas de las muestras de los experimentos anteriores se llevó acabo la técnica de Lowry en donde se les adicionó NaOH 1N y a los 30 min. De incubación se agregó reactivo C que contiene Na2CO3 y CuSO4 que lo que va a hacer el cobre es formar complejo con los aminoácidos con el nitrógeno y el NaOH es para desnaturalizar las proteínas y dejar expuestos los grupos fenoles de la tirosina para que...