Frotis bacteriano

PRACTICA 1. PREPARACIÓN DE FROTIS BACTERIANO. TINCIÓN DE GRAM

Palabras claves: Tinción de Gram, Frotis Bacteriano, Cristal Violeta, Gram positivo.

Introducción. La tinción de Gram es usada para clasificar bacterias sobre la base de sus formas, tamaños, morfologías celulares y reacción Gram (color). A nivel del laboratorio es útil como test para un rápido diagnóstico presuntivo de agentesinfecciosos, tanto en muestras como en cultivos en crecimiento, y adicionalmente sirve para valorar la calidad de la muestra clínica. Las bacterias se tiñen gram positivas (+), gram negativas (–) o no se tiñen debido a sus diferencias en la composición de su pared y arquitectura celular.

Esta técnica de coloración de contraste fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. Es de considerarseque la reacción de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio, y quizá por otras causas. La capacidad de las células para captar la coloración Gram solo es aplicable de manera adecuada en bacterias; como puede advertirse en las células de vegetales y animales superiores, que no conservan uno de los colorantes de los que está compuesta la técnica; loshongos miroscópicos se tiñen con cierta irregularidad; los gránulos de micelios tienden a retener el colorante. (2)

Las bacterias gram (+) tienen una gruesa capa de péptidoglucano y gran cantidad de ácidos teicóicos que no son afectados por la decoloración con alcohol y/o acetona, reteniendo el colorante inicial acomplejado con iodo y visualizándose en distintos grados de tonos desde elvioleta al azul claro, dependiendo de si la naturaleza de su pared celular está intacta o dañada (por tratamientos antibióticos, edad celular,etc).

Las bacterias gram (–) tienen en su pared celular una delgada capa de peptidoglucano ligada a una membrana externa por moléculas de lipopolisacáridos. Esta membrana externa es dañada por el alcohol y/o acetona de la decoloración, permitiendo que elprimer colorante acomplejado con iodo escape y sea reemplazado por el contracolorante.

Clásicamente los reactivos utilizados para la realización de la tinción de Gram han sido el cristal violeta como colorante inicial, la solución de lugol para acomplejar a éste, el alcohol y/o acetona para la decoloración y la safranina o fucsina básica como contracolorante. (1)

Metodología. Lo primero que sehizo fue preparar y fijar el frotis bacteriano a partir de un cultivo que no tuviera más de 24 horas de haber sido preparado, luego con un mechero, se flamearía un asa bacteriológica para esterilizarla y esperar que esta se enfriara un poco. Se toma el portaobjetos y se le deposita una gota de solución salina donde se depositara la muestra, tomada la muestra con el asa del cultivo bacteriano, seprocede luego a depositar la muestra en el portaobjetos mediante movimientos circulares con el fin de extenderla en todo el portaobjetos, luego se calentó el portaobjetos con ayuda del mechero sin calentar en exceso con el fin de fijar la muestra para no dañar a las bacterias que se quieren observar.

Ya obtenido el frotis bacteriano de la muestra, se procede a teñirlo con cristal violeta,utilizando lo suficiente de dicho colorante para lograr cubrirla por completo. Se deja cubierto con el colorante alrededor de un minuto. Transcurrido el minuto, se debe enjuagar el portaobjetos que posee la muestra con agua destilada.

Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica yodo (como mordiente) durante 1 minuto más. Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora conuna mezcla de alcohol-acetona, hasta que ya no escurra el líquido azul.

Se vuelve a lavar con agua destilada para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lámina. Ya seco el portaobjetos, se procede a teñir nuevamente, utilizando safranina, dejando actuar esta durante 1 minuto.

Pasado el minuto, se procede a enjuagar la lámina con agua destilada nuevamente, se escurre el...