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transcriptasa inversa

EXPRESIÓN Y DETECCIÓN POR WESTERN BLOT DE LA PROTEÍNA p66 DEL VIH
El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un retrovirus que conduce a una pérdida de
función del sistema inmune, causando así infecciones oportunistas. El VIH infecta
principalmente las células T ayudadoras, (específicamente CD4+), macrófagos y células
dendríticas. Este virus causa unadisminución de las células CD4+ mediante tres mecanismos
principales:
1. Muerte directa de las células infectadas.
2. Elevación de la tasa de apoptosis en las células infectadas.
3. Reconocimiento y muerte de las células infectadas por linfocitos CD8 citotóxicos.
Cuando el número de células CD4+ disminuye hasta llegar a un nivel crítico, la inmunidad
mediada por células se pierde y el cuerpo sevuelve de manera progresiva más susceptible a
infecciones oportunistas.
El VIH está clasificado dentro el género Lentivirus de la familia Retroviridae. Los lentivirus
tienen características morfológicas y biológicas comunes entre sí e infectan diversas especies,
causando enfermedades de larga duración con prolongados tiempos de incubación. Los
lentivirus son transmitidos como una cadena de RNAsencilla positiva que, al entrar en la célula
diana, es convertida en DNA de cadena doble por una transcriptasa reversa codificada por el
gen pol del virus. La transcriptasa reversa es un heterodímero compuesto por dos subunidades
denominadas p66 y p51.
En esta práctica se expresará la subunidad p66 de la transcriptasa reversa de VIH-1 unida a un
epítopo T7 (MASMTGGQQMG), que contiene 11aminoácidos de la proteína mayor de la
cápside del bacteriófago T7 y permite su identificación con un anticuerpo específico.
Posteriormente se realizará un inmunoblot para detectar de manera específica la proteína
expresada. La expresión se realizará en bacterias de la especie Escherichia coli cepa BL21 (DE3)
Rosetta transformadas con el plásmido pET24d>a p66 y crecidas previamente hasta unadensidad óptica (D.O.) de 0,5 medida a 600nm. La inducción de la expresión se iniciará tras la
activación del promotor Lac por adición de IPTG al medio de cultivo.
El plásmido en el que se encuentra el gen de la subunidad p66 recombinante es el siguiente:

Lac Promotor

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2.- SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE p66 MEDIANTE ELECTROFORESIS
La electroforesis es una técnica de separación demoléculas mediante su migración en un
campo eléctrico, es decir, las moléculas deben estar cargadas para poder migrar. Las
moléculas se mueven hacia el electrodo de carga contraria impulsadas por una fuerza que es
proporcional a la carga de la molécula.
Cada una de estas moléculas estará sometida a una aceleración igual al cociente entre la
fuerza ejercida por el campo eléctrico y la masa de lamolécula. Si conseguimos que todas las
moléculas, en este caso proteínas, alcancen la misma relación carga/masa, lograremos que
todas ellas sean sometidas a la misma aceleración. Es decir, en circunstancias ideales en las
que no existieran fuerzas de rozamiento que se opusieran al movimiento, todas las proteínas
migrarían a la misma velocidad. En nuestro caso buscamos precisamente separar lasmoléculas
en función del rozamiento que encuentran durante su movimiento y por ello utilizamos
soportes con capacidad absorbente (como los geles de poliacrilamida, de almidón o de
agarosa). De esta manera las proteínas se separan en función de la mayor o menor resistencia
que el soporte hace a su avance. En el caso de que todas las proteínas tengan una forma
similar, el único parámetro quedetermina la fuerza de rozamiento es su tamaño molecular
(masa).
Es muy importante tener en cuenta por tanto que el requisito esencial para que las proteínas
puedan separarse en función de su masa es que todas ellas tengan una misma forma
(extendida) y una misma relación carga/masa. Ello se consigue mediante calentamiento de las
muestras a 100oC en presencia del detergente SDS y de...