Hibridacion Molecular

Bol. San. Veg. Plagas, 21: 19-27, 1995

Hibridación molecular de Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis y otras bacterias con la sonda MIC1
S. LLAMAS y C. NOVAL

Quince cepas de Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, 8 de C m subsp. insidiosus, 2 d e C m subsp. sepedonicus, 1 Pseudomona solanacearum, 1 Erwinia carotovora subsp. carotovora, 7 del género Arthrobacter y 30saprofitos de tomate fueron hibridadas mediante la técnica Dot-Blot con la sonda específica d e C m subsp. michiganensis, MIC1, para determinar la especificidad y sensibilidad de esta sonda en la detección del agente causante del Chancro del tomate. S. LLAMAS y C. NOVAL. Subdirección General de Sanidad Vegetal. Velázquez, 147. 28002 Madrid. Palabras clave: Chancro del tomate, sondas de ADNINTRODUCCIÓN Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al (Cmm) es el patógeno causante de la enfermedad conocida como Chancro bacteriano del tomate u Ojo de párajo que fue descrita por primera vez en 1910 en EE.UU. (Smith, 1910). Como consecuencia de la importación de semillas americanas la enfermedad aparece en Dinamarca en 1922 (WEBER, 1922). Actualmente ha sido detectada en lasprincipales áreas tomateras de todo el mundo. En España es a partir del año 1978 cuando el patógeno comienza a localizarse gradualmente en puntos diversos, tanto en cultivos al aire libre como en invernadero (NOVAL, 1990). El diagnóstico de la enfermedad es difícil. Por una parte los síntomas que pueden manifestar las plantas son variables y dependen de las prácticas culturales o del cultivarafectado; además el patógeno es capaz de encontrarse latente en la planta durante períodos bastante largos (EPPO, 1992). El empleo de semillas infectadas es la fuente principal de transmisión de la enfer-

medad (EPPO, 1992). Aunque se sabe que esta transmisión ocurre a niveles menores del 1%, este porcentaje de infección en los semilleros puede motivar un 100% de infecciones en los transplantes(ENDO, 1975, GROGAN y KENDRICK, 1953). Existen diferentes métodos para la detección de la enfermedad, basados principalmente en tinción de inmunofluorescencia indirecta y en siembras en medios semiselectivos (FATMI y SCHAAD, 1989, GIATITIS et al, 1989, NOVAL, 1991, RAT, 1984, VAN VAERENBERG y CHAVEAU, 1987, VAN VAERENBERG et al, 1993).

Debido a la importancia que presenta la detección temprana delpatógeno y a las dificultades que pueden entrañar los métodos precedentes, el Grupo de Expertos en Bacterias de la CE, está llevando a cabo un proyecto en el que se estudia, entre otras técnicas, la hibridación molecular con sondas de ADN. Esta técnica es ampliamente utilizada en diagnosis de enfermedades humanas y de
animales (EDELSTEIN, 1986, ROSEN, 1987,
VAN BRUNT

y KLAUSNER, 1987)emplean-

dose también desde hace algunos años para la detección de organismos fitopatógenos (SCHAAD et al., 1986). En el caso de Cmm se han realizado diversos estudios que han conducido a la obtención de sondas para este patógeno (JOHANSEN et al, 1989, THOMPSON et al, 1989). Sin embargo, la gran analogía existente entre los genomas de las especies de Clavibacter michiganensis (VIDAVER, 1982, VIDAVERy STARR,

marcada por incorporación de biotina mediante un «nick translation» empleando el kit «BioNick Labelling System» de BRL según el protocolo recomendado por el fabricante.

1981) hace difícil encontrar sondas específicas. En este trabajo se exponen los resultados que se han obtenido en nuestro laboratorio al estudiar la especificidad y sensibilidad de la sonda MIC1 (desarrollada por elEngineering Group Lyngby, Dinamarca) frente a Cmm y otras bacterias. MATERIAL Y MÉTODOS Cultivos y mantenimiento de las bacterias Se estudiaron 64 microorganismos, entre los que figuran 15 aislados de Cmm, 8 de Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus (Me Culloch) Davis et al, 1984 (Cmi), 2 aislados de Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Spieckermann y Kotthoff) Davis et al, 1984...