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TRONCO COMUN DIVISIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD.
MODULO: ENERGIA Y CONSUMO DE SUSTANCIAS FUNDAMENTALES
PREACTICA No. 2
DETERMINACION DE PROTEINAS.
METODO DE BIURET
OBJETIVO:
Manejar en el laboratorio el método de Biuret para determinar proteínas.
Observar y determinar experimentalmente el efecto del PH sobre las proteínas de la leche.

METODOLOGÍA:Investigación bibliográfica de los estudiantes sobre colorimetría y punto isoeléctrico de proteínas.
MATERIAL POR EQUIPO:
1 probeta de 50 ml
2 gradillas
2 pipetas de 10 ml
3 pipetas de 5 ml
1 pipeta de 1 ml
Tubos de 15 x 100 – 12 piezas
1 vaso de precipitados de 100 ml
12 tubos de 16 x 150
1 balanza granataria
Papel parafilm para 10 tubos
Si es necesario, 1 embudo y papel filtro.
REACTIVOSPOR EQUIPO:
Agua destilada
Solución de ácido acético 0.1 N
Solución de acetato de sodio 0.1 N
Solución de caseína (concentración 4mg/ml)
Reactivo de Biuret 50ml.
APARATOS POR EQUIPO:
1centrifuga clínica
1 balanza granataria
4 espectrofotómetros
4 celdas
LOS ALUMNOS DEBERAN TRAER POR EQUIPO:
6gr. Aproximadamente de leche en polvo descremada
1 plumón indeleble
Masking tape
Jabóny franela para limpiar.
1. DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO.
1.1. Preparación de una serie de tubos con solución amortiguadora de acetatos.
Coloca en una gradilla 6 tubos de 15 x 100 rotulados con números consecutivos.
Adiciona a cada tubo las soluciones ácido acético y acetato de sodio que indica la siguiente tabla:

TUBO
Solución ácido acético 0.1 N
Solución acetato de sodio 0.1N
1
5 ml

2
4 ml
1 ml
3
3 ml
2 ml
4
2 ml
3 ml
5
1 ml
4 ml
6

5 ml

El volumen final de cada tubo deberá ser de 5ml.

2. PREPARACION DE LA LECHE
2.1 En un vaso de precipitados de 100 ml disuelve 6 gr. De leche en polvo descremada, con 50 ml de agua destilada.
NOTA: añade el agua poco a poco para evitar que se formen grumos que podrían dificultar la obtención de una soluciónhomogénea. No debes calentar la leche para disolverla.
2.2. En un tubo de ensaye de 16 x 150 mm mide 2 ml de la leche rehidratada preparada como se indicó anteriormente y añade 8 ml de agua destilada, agita cuidadosamente por inversión. Esta muestra de leche diluida (1:5) se ocupará para llevar a cabo la determinación del punto isoeléctrico de las proteínas descrito en el siguiente párrafo:3. PUNTO ISOELÉCTRICO.
3.1. Añade 1 ml de la leche diluida (1:5) a cada tubo de solución amortiguadora que preparaste en el punto 1.
3.2. Mezcla cuidadosamente por inversión todos los tubos y deja reposar por espacio de 10 minutos. Observa el aspecto de las mezclas preparadas. En el tubo donde observes grumos de leche suspendidos en la solución te indicará que las proteínas de la leche se haninsolubilizado debido al pH de la solución este pH es denominado PUNTO ISOELÉCTRICO.
3.3. Centrifuga los tubos a 2500 r.p.m. durante 10 minutos NO SIN ANTES BALANCEARLOS. Deberá pesar lo mismo que aquel tubo que ocupará el lugar opuesto dentro de la centrifuga.
3.4. Separa el sobrenadante (cuidando de no re suspender el precipitado acumulado en el fondo del tubo) y transfiere a tubos limpiosde 15 x 150 mm, rotúlalos con el número de tubo que les corresponde.
4. DETERMINACION DE PROTEÍNAS CON EL METODO DE BIURET.
4.1. Coloca en una gradilla 11 tubos de 16 x 150 mm, rotula uno de ellos como número cero, el cual llevará los reactivos para calibrar el espectrofotómetro (blanco de reactivos o testigo) los siguientes 4 tubos llevarán números consecutivos del 1 al IV y los restantes (del1 al 6) los rotularás con el número que corresponda a los sobrenadantes obtenidos por centrifugación según se indicó en el punto 3.4.
4.2. Añade a cada tubo los reactivos para determinar proteínas en la curva de calibración (tubos I a IV) y en los sobrenadantes (tubos 1 a 6) de acuerdo a lo indicado en la siguiente tabla:

CURVA DE CALIBRACIÓN TUBOS PROBLEMA...