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Producción y purificación de la Taq DNA polimerasa a partir de E. coli recombinante
Jorge Guillermo Gómez Gutiérrez*, Luis G. Bermúdez Humarán*, Reyes Tamez Guerra*, Juan Manuel Adame Rodríguez**, Roberto Montes de Oca Luna*

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a DNA polimerasa de Thermus aquaticus (Taq DNA polimerasa) es la enzima usada en el procedimiento del PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Este es un métodoextraordinario para la síntesis de ácido desoxirribonucleico (DNA) in vitro. El PCR puede amplificar un gen o un fragmento específico de DNA en varios millones de veces en menos de dos horas. Sus vastas aplicaciones dieron lugar a un avance vertical en el área de las ciencias biológicas. Dentro de algunas de las aplicaciones del PCR se encuentran el diagnóstico molecular de enfermedades genéticashumanas, de infecciones virales y bacterianas, en estudios de evolución molecular, clonación y expresión de genes, identificación de individuos, etc. El PCR es una reacción de varios ciclos en cadena, donde cada ciclo se compone de tres etapas que son: (a) desnaturalización del DNA, (b) hibridación de oligonucleótidos y (c) síntesis de DNA. En el primer paso se separan las cadenas de DNA atemperaturas de aproximadamente 94oC, esto permite que en el segundo paso se hibriden los oligonucleótidos a la región de DNA que se desea amplificar y, finalmente, en el tercer paso la enzima Taq DNA polimerasa lleva a cabo la síntesis de DNA a una temperatura de 72 oC. Estos tres pasos se repiten en un promedio de 30 veces. Es decir, que durante cada ciclo los componentes de la reacción pasan portemperaturas muy elevadas a las cuales se inactivan la mayoría de las enzimas. Originalmente el procedimiento del PCR se estableció usando la DNA polimerasa I de Escherichia coli. 1 Esta enzima no es resistente a las temperaturas usadas en la desnaturalización del DNA y por ende se adicionaba nueva enzima después del primer paso en cada ciclo de reacción. Este problema se resolvió al sustituir la DNApolimerasa I de Escherichia coli por una
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Representación tridimensional de la Taq DNA polimerasa.

enzima termoestable que no perdía su actividad a dichas temperaturas. Esta enzima es la Taq DNA polimerasa producida por la bacteria termófila Thermus aquaticus.2 La Taq DNA polimerasa simplificó en gran medida la reacción de PCR al prescindir de adicionar enzima en cada uno de los 30 ciclosque se repite la reacción. La importancia que cobró esta enzima determinó que se establecieran procedimientos para facilitar su purificación, a partir de la bacteria productora de esta enzima, Thermus aquaticus. Posteriormente, con el uso de la tecnología del DNA recombi*Laboratorio de Inmunología y Virología. **Laboratorio de Micología Médica, Facultad de Ciencias Biológicas, UANL,jadame@ccr.dsi.uanl.mx

CIENCIA UANL / VOL. V, No. 3, JULIO-SEPTIEMBRE 2002

JORGE GUILLERMO GÓMEZ G., LUIS G. BERMÚDEZ H., REYES TAMEZ G., JUAN MANUEL ADAME R., ROBERTO MONTES DE O.

nante el gen de la Taq DNA polimerasa se clonó a partir de T. aquaticus y se expresó en Escherichia coli.3 La expresión de este gen en E. coli facilitó su producción y purificación.4 En el presente trabajo se describe laadaptación de un procedimiento para la producción y purificación de esta enzima Taq DNA polimerasa, a partir de una cepa recombinante de E. coli.

nientes de cada medio, LB y TB. Inducción de la expresión del gen Taq Para determinar el tiempo óptimo de producción de Taq DNA polimerasa, básicamente se hizo lo mismo que en el procedimiento anteriormente descrito, con la diferencia que solamente secrecieron las bacterias en el medio LB, ya que como se verá más adelante (resultados) en éste se obtuvo mayor actividad enzimática que en el medio TB. Se tomaron muestras de 1ml del cultivo celular cada dos horas durante 18h, a partir de la inducción con IPTG. Se prepararon extractos celulares, mediante sonicación, y se les determinó la actividad de Taq DNA polimerasa, de acuerdo a lo descrito en...