Informe Enzima Sacarasa

Introducción:
La sacarasa o invertasa es una hidrolasa que cataliza la hidrólisis de la sacarosa liberando glucosa y fructosa.
Los glúcidos liberados por la acción de esta enzima son capaces dereducir en medio alcalino al ácido pícrico, de color amarillo, convirtiéndolo en ácido picrámico, de color rojo. La intensidad de la coloración obtenida, medida espectrofotométricamente, es proporcionala la cantidad de glúcidos reductores presentes en la muestra.
Objetivos:
Nuestro objetivo es calcular los valores cinéticos (Km y Vmax) de la enzima sacarasa y determinar si presenta cinéticaMichaeliana.

Materiales y métodos
Reactivos utilizados:
Levadura de cerveza;
Agua destilada;
Solución de sacarosa 2% p/v;
Hidróxido de sodio 10% p/v;
Solución de ácido pícrico concentrado.Equipamiento:
Siete tubos de ensayo;
Incubadora;
Espectrofotómetro;
Pipetas;
Centrifugadora;
Curva de calibración.

Procedimientos del trabajo práctico:
1. Se centrifuga una suspensión delevaduras (1 g de levadura de cerveza cada 100 mL de agua destilada) durante 10 minutos a 3000 rpm. Esto nos permite separar las enzimas del resto de la levadura.
2. Utilizando la pipeta se colocan en cadauno de los 7 tubos de ensayo 0,5 mL del extracto enzimático.
3. A continuación, también por medio de la pipeta, se agrega la solución de sacarosa 2% p/v, variando el volumen como indica la tabla deresultados (ver abajo).
4. Se completa cada tubo de ensayo con agua destilada hasta alcanzar los 10 mL.
5. Se mezcla por agitación cada uno de los tubos e incubamos a 37 ºC durante 10 minutosmientras la enzima actúa.
6. Se coloca 1 mL de NaOH en los tubos para brindarle a los glúcidos el medio básico que necesitan para reaccionar con el ácido pícrico.
7. Se agrega, a continuación, 2 mL deácido pícrico en cada uno de los tubos.
8. Se agitan y calientan los tubos en agua hirviente durante 5 minutos. Se retiran del agua y se dejan enfriar. En este paso, se espera que los glúcidos...