Informe

Informe de práctica.
Determinación de
proteínas



28/11/2010








Determinación de proteínas:
Método de Bradford

El objetivo de esta práctica es medir la concentración de proteínas en un extracto
enzimático. Para ello se utilizó el método de Bradford, el cual se basa en el cambio de color de
ciertos tintes al unirse a las proteínas. Es además un método muysensible pues detecta
cantidades del orden de µg de proteína.

Asimismo en la realización de esta práctica se utilizó el “Azul Coomasie Brillante”, un
tinte que en solución ácida presenta un color rojo-pardo, aunque cuando se adsorbe sobre la
superficie de las proteínas cambia su espectro de absorción presentando un pico a 595 nm y
dando un color azul intenso. Esto se debe al hecho deque únicamente la forma aniónica de
este tinte mencionado es capaz de unirse a proteínas, unión que tiene lugar mediante puentes
salinos y fuerzas de Van der Waals. Es necesario recalcar que este color es proporcional a la
concentración de proteínas en la muestra, dato que se puede obtener comparando el color
con el que produce una serie de soluciones de concentración conocida de unaproteína patrón;
en esta práctica en concreto dicha proteína corresponde a la albúmina sérica bovina (BSA).

Tubo

Albúmina

ml

Agua

ml

Bradford

ml

Blanco

---

1.0

4.0

1

0.1

0.9

4.0

2

0.2

0.8

4.0

3

0.4

0.6

4.0

4

0.6

0.4

4.0

5

0.8

0.2

4.0

6

1.0

---

4.0



MuestraAgua

Bradford

M1

0.2

0.8

4.0

M2

0.4

0.6

4.0

M3

0.6

0.4

4.0

Así pues para la determinación de proteínas usando el método de Bradford se hizo uso
de los siguientes materiales y reactivos: gradillas, tubos de ensayo, pipetas, un colorímetro, el
reactivo de Bradford y finalmente la albúmina patrón, que como ya se ha mencionado es laalbúmina sérica bovina, 0.1 mg/ml.

Para lograr el objetivo de esta práctica, se dispuso de una gradilla con siete tubos de
ensayo y se pipetearon cantidades crecientes de la albúmina patrón anteriormente
mencionada, completando el volumen a 1 mL en cada tubo, según la tabla que posteriormente
se adjuntará. Hay que tener en cuenta que en esta práctica se trabajó con las muestrasproblemas H, que anteriormente se habían diluido en agua en proporción 1:200 (hecho que ya
se había completado independientemente de la práctica). Después de todo esto se pipetearon
cantidades relativas a 0.2, 0.4 y 0.6 mL de la disolución en los tubos de muestras problema y
se completó el
volumen con agua
como en los
anteriores tubos.





Finalmente,
y tras la
preparación de lamezcla proteína-
agua en cada tubo


patrón así como en cada tubo de muestra problema, se añadió el reactivo de Bradford
rápidamente a todos los tubos. Se pipeteó en cada tubo 4 ml de dicho reactivo, se agitaron
bien los tubos, luego se dejaron reposar durante 5 minutos aproximadamente y por último se
leyeron las absorbancias a 595 nm con la ayuda de un colorímetro. Los datosobtenidos tras la
cumplimentación de este procedimiento experimental se recogen en la siguiente tabla:



Tubo

Alb, mg

A595

1

0.01

0.150

2

0.02

0.229

3

0.04

0.403

4

0.06

0.545

5

0.08

0.658

6

0.1

0.744

M1



0.231

M2



0.392

M3



0.536



Las cantidades de albúmina (mg) seobtuvieron mediante sencillos cálculos, tomando
como referencia la cantidad de albúmina sérica bovina inicial. Es decir, teniendo en cuenta que
la cantidad de BSA patrón era del orden de 0.1 mg en un mL, con una simple regla de tres se
resuelven las cantidades correspondientes a cada tubo patrón. Por ejemplo:


. Xmg Ab = 0.01 mg Alb (primer tubo patrón)




. Xmg Ab = 0.02 mg Alb...