Inmunofluorescencia

Inmunofluorescencia


En 1944 Albert Coons mostró que era factible marcar los anticuerpos con moléculas que tienen la propiedad de la fluorescencia. Las moléculas fluorescentes absorben luz de unalongitud de onda (excitación) y emiten luz de otra longitud de onda (emisión). Si las moléculas de anticuerpo se marcan con un colorante fluorescente, o fluorocromo, los complejos inmunitarios quecontienen estos anticuerpos marcados con fluorescencia (FA) pueden detectarse por la emisión de luz de color cuando se excitan con una luz de longitud de onda apropiada. Es posible observar de manerasimilar moléculas de anticuerpo unidas a antígenos en células o cortes de tejido. La luz emitida puede verse con un microscopio de fluorescencia, que está equipado con una fuente de luz UV. En estatécnica, que se conoce como inmunofluorescencia, suelen emplearse compuestos fluorescentes, como fluoresceína y rodamina, pero también otras sustancias muy fluorescentes, por ejemplo ficoeritrina, unpigmento de color muy intenso y muy fluorescente obtenido de algas. Estas moléculas pueden conjugarse con la región Fc de una molécula de anticuerpo sin afectarla especificidad de éste. Cada uno de losfluorocromos que se mencionan a continuación absorbe luz en una longitud de onda
y emite luz a una longitud de onda más larga:

Fluoresceína, un colorante orgánico que es el marcador más utilizado paraprocedimientos de inmunofluorescencia, absorbe luz azul (490 nm) y emite una fluorescencia
verde-amarillo intensa (517 nm).
Rodamina, otro colorante orgánico, absorbe en el intervalo del verde y elamarillo (515 nm) y emite una fluorescencia roja intensa (546 nm).

Ficoeritrina absorbe luz de manera eficiente y es un emisor brillante de fluorescencia roja, lo cual la hace de uso amplio como unmarcador de inmunofluorescencia.

Distinguimos entre dos métodos de IF, dependiendo de si el fluoróforo está conjugado al anticuerpo primario o al secundario:

IF directa: utiliza un único...