Inmunofluorescencia

La inmunofluorescencia es una técnica para demostrar la presencia de determinadas moléculas mediante el uso de anticuerpos unidos químicamente a sustancias fluorescentes (fluoróforos). Los anticuerpos tienen la capacidad de unirse con una alta especificad a determinadas moléculas, llamadas moléculas blanco. En esta técnica, la molécula blanco será fluorescente. De modo que los anticuerpos losmarcamos con moléculas fluorescentes.
Las sustancias pueden tener diversas propiedades, entre ellas se encuentran la luminiscencia o fotoluminiscencia, fosforescencia y fluorescencia. La primera propiedad consta en almacenar energía luminosa que posteriormente se liberará como energía luminosa. La fosforescencia son periodos en los que la sustancia almacena a largo plazo la fosforescencia y suemisión ocurre mucho después de que acabe su excitación. Y la última de las propiedades y en la que nos vamos a centrar es la fluorescencia.
La fluorescencia a diferencia de la fosforescencia se almacena en periodos cortos y se da enseguida su emisión. Esta propiedad la tienen unas moléculas, los fluoróforos, de modo que la fluorescencia es el resultado de un proceso que ocurre en diferentesetapas.
Fluoróforos o fluorocromos:
Los fluoróforos son generalmente compuestos heterocíclicos o hidrocarbonos poliaromáticos. Cada uno de ellos tiene dos espectros característicos; el de emisión y el de excitación. En la tabla 1 se citan diferentes compuestos con sus correspondientes espectros de emisión y excitación. Las imágenes 1, 2 y 3 nos muestran como son algunas de estas moléculasfluorescentes.

Los pasos en los que ocurre la fluorescencia son tres; la excitación de la molécula, la duración en el estado excitado y la posterior emisión de fluorescencia.
1. Excitación: Por una fuente externa se le entrega al fluoróforo un fotón de energía que éste absorberá, pasando a un estado excitado.
2. Estado excitado: La molécula sufre cambios conformacionales en un periodo detiempo que se encuentra habitualmente entre 10-9 y 10-8 segundos. La energía absorbida es disipada parcialmente hasta llegar a un estado excitado relajado a partir del cual se emite la fluorescencia.
3. Emisión: se emite un fotón de modo que el fluoróforo vuelve a su estado de energía inicial. Como se disipa algo de energía en el estado excitado, la energía con la que el fluoróforo emite ahorael fotón es menor que la absorbida.
En la Imagen 4 se ve resumido este proceso, donde S0 es el estado inicial del fluoróforo, S1’ el estado excitado y S1 el estado excitado relajado. hνEX es la energía que absorbe el fluoróforo y hνEM la energía del fotón que posteriormente se emite, siendo hνEX > hνEM ya que se disipa algo de energía en el paso de S1’ a S1.


Para obtener una intensidadde fluorescencia satisfactoria es necesario utilizar como radiaciones de longitud de onda correspondientes a los máximos de absorción del fluoróforo, que como hemos visto en la Tabla 1 depende del tipo de fluoróforo.
Cuando los compuestos fluorescentes se unen a los anticuerpos dan lugar a conjugados, de modo que estos conjugados han de cumplir varias características:
• Debe tener fluorescenciaintensa.
• Ha de tener una reacción específica con los antígenos, que es donde luego se unirá el anticuerpo marcado con la molécula fuorescente, de modo que podremos conocer los antígenos que se encuentren en una muestra.
Y estas propiedades que han de cumplir los conjugados dependen de diferentes factores:
• Las propiedades de la sustancia fluorescente.
• Modificaciones que bien el antígeno oel anticuerpo pueden sufrir cuando se acoplan.
Pero también influyen:
• La intensidad de la marcación.
• La homogeneidad de la marcación; cuando la marcación es muy alta, la fluorescencia es inespecífica y cuando lo están poco, la fluorescencia es poco intensa, por ellos, la marcación ha de ser media.
• Y la presencia en el conjugado de otras moléculas marcadas.
La luz emitida por el...