invertasa

31. Extracción y ensayo de la actividad invertasa
de levadura de panadería
Manuel Tena Aldave, Jesús V. Jorrín Novo
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales,
Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba

RESUMEN

En la presente práctica se llevará a cabo la extracción y ensayo de la
actividad invertasa de levadura de panadería, utilizando como materialde
partida un preparado liofilizado de levadura comercializado por la casa
Sigma. La velocidad de reacción se determinará analizando la cantidad de
azúcares reductores formados (D-glucosa + D-fructosa, expresadas como
equivalentes de glucosa) producida por unidad de tiempo y la actividad
enzimática se expresará como actividad específica (p.e. µkat mg-1 de
proteína). A tal fin, la cantidad deazúcares reductores se determinará
colorimétricamente por el método del ácido dinitrosalicílico, y la cantidad
de proteína presente en el extracto enzimático se analizará por el método
de Bradford. Eventualmente se considerará un protocolo de purificación
parcial de la actividad extraída, mediante precipitación con sulfato
amónico.
Palabras clave: azúcar invertido, β-D-fructofuranosidasa;Saccharomyces
cerevisiae.
Abreviaturas empleadas: BSA, seroalbúmina bovina; DNS, ácido 3,5dinitrosalicílico.

1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
La invertasa (β-D-fructofuranosidasa, β-D-fructofuranósido fructohidrolasa,
EC 3.2.1.26), cataliza la hidrólisis de restos terminales no reductores β-Dfructofuranosídicos de fructofuranósidos. Entre los sustratos sobre los que
actúa el más significado es,sin duda, la sacarosa, de ahí que el enzima se
designe con el nombre de sacarasa. La denominación trivial de invertasa, con
la que también se conoce, hace referencia al hecho de que los productos de la
reacción son conocidos desde antiguo como “azúcar invertido” ya que mientras
la sacarosa es dextrorrotatoria, la mezcla equimolecular de glucosa y fructosa
que resulta de su hidrólisis eslevorrotatoria, por lo que en el proceso se origina
un cambio de signo (de positivo a negativo) del valor de rotación óptica.
Sacarosa ([α]D= +66,5º) + H2O →
D-glucosa ([α]D= +52,5º) + D-fructosa ([α]D= -92º)
La invertasa es un enzima ampliamente distribuido, estando presente tanto
en microorganismos como en animales y vegetales, jugando un papel
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importante en el catabolismo de fructanos ymás específicamente en el de la
sacarosa, en especial en aquellos organismos en los que dichos azúcares son
utilizados como fuente de carbono y energía.
El estudio de la actividad invertasa presenta un gran interés tanto desde un
punto de vista académico como de investigación aplicada, siendo uno de los
enzimas más conocidos. A modo de ejemplo podemos referir que la invertasa
fue el primerenzima cuya cinética se estudió en profundidad (estudios clásicos
de Michaelis-Menten) y que fue utilizado industrialmente.
Para la determinación de la actividad invertasa se utilizará un ensayo
indirecto en el que los productos de reacción serán detectados
espectrofotométricamente tras su conversión en derivados coloreados. En
concreto, la extensión de la hidrólisis enzimática de sacarosa(azúcar no
reductor) en glucosa más fructosa (azúcares reductores) se valorará mediante
uno de los diversos métodos existentes para la estimación de azúcares
reductores. Nos referimos exactamente al método del ácido 3,5-dinitrosalicílico
(DNS), el cual se basa en la reducción del DNS (de color amarillo) por la
glucosa u otro azúcar reductor al ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (de color rojoladrillo) (Chaplin, 1986), cuya presencia puede detectarse por lectura de la
Absorbancia en la zona de 540-570 nm.

Ácido 3,5-dinitrosalicílico
(amarillo)

D-Glucosa

Ácido 3-amino-5-nitro
salicílico (rojo)

Ácido D-glucónico

En la presente Práctica aplicaremos el método DNS a una gama de
soluciones patrón de glucosa, al objeto de obtener la correspondiente curva de
calibrado que,...