La historia de la bioquimica y su evolucion

6. Espectrofotómetro
El espectrofotómetro es el instrumento más versátil del laboratorio, ya que, como puede observarse en la tabla 1, puede utilizarse para diferentes determinaciones analíticas. La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que se fundamenta en la absorción de estas radiaciones por parte de las moléculas. Por ello el espectrofotómetro está constituido por un foco deradiación visible o ultravioleta, que emite una radiación que atraviesa un selector, que permite escoger una radiación de una longitud de onda (λ) concreta. La radiación seleccionada incide sobre la muestra contenida en una cubeta transparente. Una parte de la radiación es absorbida, mientras que el resto es transmitida y se mide en un detector.
Cada molécula en función de su configuraciónelectrónica puede absorber unas radiaciones específicas, que se caracterizan por su longitud de onda. Las moléculas en solución pueden absorber radiaciones de la zona ultravioleta (λ»195-325nm) o de la luz visible (λ»325-800nm). En el caso de la absorción de la luz visible, esta absorción es la razón por la cual las soluciones se vean coloreadas. Así, el vino tinto es de color rojo porque absorberadiaciones entre 400-700nm, con un máximo en 520nm.
Si cada molécula de un analito absorbe una radiación característica, la medida de toda la radiación absorbida nos permite medir la cantidad de moléculas, es decir, la concentración. La absorbancia (A), que se calcula a partir de la medida experimental de la radiación incidente y de la transmitida, y la concentración se hallan relacionadas por la leyde Beer-Lambert: A=axbxC, donde b es el camino óptico (espesor de la cubeta) y a es la absortividad específica, que es característica para cada analito, pero depende de la longitud de onda de la radiación absorbida y de las características de la solución (matriz) que contiene al analito. Para el análisis cuantitativo se construye normalmente una recta de calibrado con patrones, procurando que lamatriz sea igual o muy similar a la de la muestra, y la absorbancia de la muestra se interpola en esta recta de calibrado con el fin de obtener la concentración.
Un espectrofotómetro se caracteriza por su rango espectral, ya que puede abarcar las zonas del visible y del ultravioleta. En enología, la gran mayoría de los análisis espectrofotométricos se efectúan en el visible, por lo que un rangoespectral de 325-800nm es suficiente. De todas formas, un rango espectral de 195-800nm permite efectuar determinaciones en el ultravioleta y, de forma muy particular, permite determinar los polifenoles totales (IPT) del vino, a partir de la medida directa de la absorbancia a 280 nm. Un espectrofotómetro UV-visible requiere una mayor inversión económica, pero la posibilidad de efectuar este análisisjustifica su adquisición.
Otro parámetro importante es la anchura de banda de la radiación incidente. Ésta debería ser inferior a 10nm, lo que puede conseguirse fácilmente tanto con filtros como con prismas o redes de difracción. Actualmente, la gran mayoría de los instrumentos incorporan redes de difracción, aunque los clásicos colorímetros, que utilizan filtros, son perfectamente válidos paratrabajar en el visible.
Las cubetas para la muestra son de especial importancia, ya que deben ser transparentes a la radiación utilizada. Se utilizan cubetas de vidrio, de cuarzo y de plástico. Para trabajar en la zona ultravioleta es imprescindible trabajar con cubetas de cuarzo, ya que tanto el vidrio como el plástico absorben en esta zona. Las cubetas de vidrio o plástico se utilizannormalmente para la zona del visible. En el momento de la medida, la cubeta debe estar con las paredes exteriores limpias y secas. Además, es de gran importancia que la muestra que contiene sea totalmente transparente y no contenga burbuja alguna. La falta de transparencia es una importante fuente de errores en el análisis espectrofotométrico y por esta razón, si procede, las muestras se filtrarán o...