Laboratorio De Enzimologia 1

Universidad Santo Tomas
Departamento de Ciencias Básicas
Santiago, 2012



Enzimología I


Curso de Bioquímica General








Introducción
Las enzimas son biocatalizadores que aceleran las reacciones químicas. El proceso organizado del metabolismo solo es posible porque cada célula dispone de un contenido enzimático determinado genéticamente. Además también participan enmuchos mecanismos de regulación que de este modo permiten que el metabolismo de adapte a diferentes situaciones (1).
Muchas enzimas son producidas por el propio cuerpo y actúan sobre las sustancias que llegan a él. Sin embargo hay factores que afectan la velocidad de una reacción, como cambios de pH y temperatura.
Los sistemas enzimáticos se coordinan de un modo muy eficaz, permitiendo unaintegración armoniosa de la multitud de actividades metabólicas diferentes que son necesarias para la vida Entre los mecanismos catalíticos empleados por las enzimas se cuenta la catálisis por iones metálicos. La catálisis suele implicar la existencia de interacciones covalentes transitorias entre el sustrato y la enzima o transferencias de grupos desde o a la enzima, con el fin de adoptar una ruta dereacción nueva y de menor energía. Las funciones de toda enzima dependen de su estructura, del pH en cual se encuentra y la temperatura de esta misma (2).
En este práctico se trabajó con la enzima α- amilasa salival, obtenida de saliva humana. Esta enzima degrada el almidón (polisacárido formado por cadenas lineales y ramificadas de glucosa) que se encuentra mayoritariamente en plantas y que esutilizado por las mismas como reserva de energía (3). La alfa amilasa hidroliza el almidón en azúcares simples, rompiendo los enlaces glucosídicos α 1-4 del almidón. El producto de esta reacción son moléculas de maltosa, maltotriosa y glucosa. Estos pueden ser reconocidos por el reactivo o ensayo de lugol.
El reactivo de lugol se utiliza para el reconocimiento de carbohidratos, el lugol estácompuesto de analitos de I yodo, cuales se unen en los enlaces glucosidicos de los carbohidratos. El Lugol no reacciona con azúcares simples como la glucosa o la fructosa. Para poder reconocer químicamente este proceso se observa el color azul morado intenso (4).

Objetivos
• Conocer algunos procedimientos para determinar la actividad de una enzima en muestras biológicas.
• Comprobar el efecto quetiene en la actividad de una enzima las variaciones de pH y temperatura.
Materiales y Métodos
Actividad 1: Efecto de la temperatura sobre actividad enzimática de amilasa salival en hidrólisis de almidón
Con un enjuague bucal, preparado con solución de NaCl al 0.9% p/v un integrante del grupo se enjuago la boca durante un minuto, obteniendo una solución con la enzima amilasa salival, la que fuefiltrada, para eliminar posibles contaminantes presentes en la solución.
Se prepararon cinco muestras en diferentes tubos de ensayos, en los que se prepararon soluciones compuestas de: 1 ml de NaCl (al 0.9% p/v), 1 ml de tampón fosfato de pH 7, 2 ml de almidón al 1% p/v y 2 ml de solución con enzima amilasa salival. A excepción de uno, el cual no contenía la solución enzimática (controlnegativo). Estas incubadas en un baño termorregulado por 15 minutos, en las siguientes temperaturas: 0°C, 15°C, 37°C, 37°C (control negativo) y 100°C.
Finalmente se añadió Lugol, para verificar la presencia de almidón en las muestras.
Actividad 2: Efecto de pH sobre actividad enzimática de amilasa salival en hidrólisis de almidón
a) Se prepararon cuatro muestras, en diferentes tubos de ensayos, en todosse preparó una solución con 2 ml de la solución enzimática, 2 ml de almidón, más 1 ml de NaCl (al 0.9% p/v) más 1 ml de buffer fosfato, variando en cada tubo el pH del buffer fosfato agregado (pH 5,0; pH 7,0; pH 9,0; pH 9,0). El segundo tubo a pH 9,0 no contuvo solución enzimática (control negativo).
Las muestras se dejaron incubando a temperatura ambiente (15°C) por 15 minutos.
Finalmente...