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Práctica Inmuno  Pruebas ELISA y Western Blot  10-11-11

ELISA y Western Blot se basan en un principio común, una reacción antígeno – anticuerpo

ELISA

ELISA se deriva del nombre en inglés Enzyme Linked Inmunosobent Assay , que en español significa ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzima.
Lleva acoplada una enzima

PRINCIPIOS BÁSICOS
Acoplar una enzima a un anticuerpo no alterasu capacidad de combinar con el antígeno específico.
El uso de un segundo anticuerpo conjugado con una enzima aumenta la sensibilidad de la prueba.

CARACTERÍSTICAS
Es una prueba de alta sensibilidad. Se pueden determinar cantidades pequeñas, en el orden de picogramos y nanogramos de lo que se está buscando (antígeno o anticuerpo).
Los resultados son cuantitativos
Los reactivos son establesy menos tóxicos
El costo es económico
Se pueden procesar grandes números de sueros en cada ensayo
Es muy versátil. Se pueden medir antígenos, anticuerpo, hormonas, etc.
Se basa en fijar uno de los reactivos a un soporte sólido, bien sea el antígeno o el anticuerpo.

PASOS (en un ejemplo de Leishmaniasis Visceral que hacen en su laboratorio)

1) Se fija el reactivo a un soporte sólidoEl reactivo es el antígeno. Se tiene un antígeno recombinante altamente específico para determinar anticuerpos contra la Leishmaniasis Visceral.
El soporte sólido suele ser una placa de microtitulación de 96 pocillos (que son de plástico llamado poliestireno). El soporte tiene la capacidad de absorber con mucha facilidad las proteínas (antígenos, anticuerpos, haptenos, etc). Entonces, se fijapor absorción el reactivo al soporte sólido.
En el ejemplo de Leishmaniasis se fija el antígeno utilizando 50 microlitos de una concentración determinada (en su laboratorio utilizan 40 nanogramos del antígeno específico). Se fijó en uno de los pocillos de la placa.
Se deja durante toda la noche a 37°. Al día siguiente se saca la placa y se hacen 6 lavados con un buffer de lavado (PBS con undetergente llamado Tween), la finalidad de los lavados es eliminar todos los antígenos que no se fijaron adecuadamente a la placa.


2) Bloqueo

Se hace con albúmina de suero bovino
La finalidad de este paso es llenar los espacios que quedaron vacíos en la placa (después del lavado) con la albúmina de suero bovino, que no interfiere con ninguno de los componentes que se utilizarán en elprocedimiento y evita que se den reacciones inespecíficas (por la capacidad de la placa de absorber proteínas).
Se deja una hora a 37°
Se saca la placa y se sacude fuertemente SIN HACER LAVADO

3) Poner en contacto la parte fija con su complementario

El complementario es la muestra que se evaluará (suero, líquido cefalorraquídeo, etc)
(En caso del ejemplo que explica se cree que el pacientepodría padecer Leishmaniasis Visceral, por lo que se evalúa el suero en busca de anticuerpos contra antígenos específicos que producen esta enfermedad).
Se hace una dilución de 1 en 100 del suero problema y se colocan 50 microlitros en la placa. Si el paciente ha estado en contacto con el parásito ha producido anticuerpos, que se fijarán al antígeno en la placa y formarán complejos antígeno –anticuerpo.
Se deja una hora a 37°
Posteriormente se lava la placa, con la intención de eliminar los anticuerpos que no se fijaron a su antígeno específico.

4) Reconocimiento del anticuerpo presente en el suero del paciente

Se utiliza un segundo anticuerpo que está marcado con una enzima. Si se está trabajando con suero humano se utiliza una antiglobulina humana, para que pueda reconocerla inmunoglobulina humana que se presume se encuentra en el suero.
El anticuerpo es comercial y viene ya marcado con una enzima. La enzima que ellos utilizan es la peroxidasa, pero se puede utilizar también fosfatasa alcalina y otras enzimas.
Se incuba por una hora en la estufa a 37°
Si hay anticuerpos para la enfermedad van a ser reconocidos por el anticuerpo secundario marcado con la...