Medico Veterinario Zootecnista

Análisis comparativo de extracción de ADN en Beauveria bassiana
López-Torres M.O., Zúñiga-Silva, Y., Orozco-Flores A., Sauceda A., Valadez-Lira J.A., Tamez-Guerra P.
Nuevo León, Facultad de Ciencias Biológicas, Departamento de Microbiología e Inmunología, Laboratorio de Inmunología y Virología. Ave. Universidad s/n, AP 46-F. Cd. Universitaria, San Nicolás de los Garza, N. L. México. 66450Keywords: Método de extracción, DNA, Beauveria bassiana, ITS, entomopatógeno.

Introducción

Beauveria bassiana es un hongo entomopatógeno de gran interés comercial en el control biológico de insectos plaga. Los entomopatógenos presentan variaciones génicas debido a su característica de parasexualidad. Los análisis moleculares de ADN permiten detectar las variaciones entre los aislamientos,razas o prototipos diferentes (Dávila, et al., 2001).
La extracción de ADN a partir de una muestra biológica es el primer paso para estudios filogenéticos y la manipulación genética. Esta consta de distintas etapas: la lisis de membrana celular, limpieza de la muestra, precipitación y resuspensión del ADN. La lisis de la membrana es un proceso esencial en el cual se liberan las sustancias delcitoplasma, haciéndolas accesibles a las pruebas mencionadas. Este proceso resulta difícil de optimizar y tiene repercusiones en la calidad final del ADN.
En el presente trabajo se compararon tres métodos de extracción de ADN: CTAB, Kit Zimo (ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep™) y con el uso de N-lauroylsarcosine sodium salt. y se estableció un control.
Con esto se pretende estandarizar yoptimizar la extracción de ADN para el análisis molecular de diferentes cepas de hongos entomopatógenos.

Metodología
Organismo
Para la evaluación de los tres protocolos de extracion de ADN se usó micelio joven de Beauberia bassiana cepa 2, Proporcionada por el Laboratorio de Producción de Organismos Benéficos del Comité Estatal de Sanidad Vegetal del Estado de Guanajuato (CESAVEG). La cualfue cultivada en 100 mL de medio liquido Sabouraud (DIBICO), en matraces PYREX de 200 mL con una agitación orbital de 150 rpm con una temperatura entre 25-30°C durante 6 días hasta obtener una cantidad suficiente de micelio para llevar a cabo los experimentos.
Se utilizaron tres diferentes métodos de extracción de ácidos nucleicos, para comparar su efectividad tanto en cantidad como en calidad deDNA. los métodos utilizados para este trabajo fueron los siguientes: Extracción de DNA con CTAB (Hexadecyltrimethylammonium bromide) (SIGMA), N-Lauroylsarcosine sodium salt (SIGMA) y ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep™ (ZIMO).

Extracción de ADN mediante Buffer CTAB.
Se centrifugo 0.5 mL de micelio joven en microtubos de 1.5 mL durante 1 min a 14,00 rpm para desechar el sobrenadante (medioliquido). El micelio fue re suspendido con 0.6 mL de buffer de extracción precalentado a 60 °C (2% CTAB, 100 mM Tris HCl pH 8.0,20 mM EDTA,1.4M NaCl,0.2% β-mercaptoethanol,0.1 mg/mL proteinasa K) estos dos últimos se adicionaron ajusto antes de su uso. Posteriormente las muestras se incubaron a 60°C por 1 hr. Después las muestras se mezclaron gentilmente y se dejaron reposar otra hora para añadir unasolución de cloroformo/alcohol isoamilico (24:1), se mezclo cuidadosamente por inversión el tubo seguido un minuto de centrifugacion a maxima velocidad a una temperatura de 4°C. Se pasó el sobrenadante a tubos nuevos y se añadio 1µL de RNasa libre de DNasa (PROMEGA) y se incubo a 37°C durante 30 min, posteriormente se adicionaron 0.6 mL de Isopropanol y se mezcló completamente por inversión,después de 2 hr ó toda la noche a temperatura ambiente, se precipita el DNA por centrifugación por 15 min a 14,000 rpm a 4°C finalmente se hicieron dos lavados con etanol al 70% para después secar la pastilla sobre un trozo de papel secante por al menos 1hr. Por último la pastilla de DNA fue resuspendida en buffer TE y se almacenar a -20°C.

Extracción de ADN mediante buffer N-Lauroylsarcosina....