Metodo Bradford

BIOQUÍMICA HUMANA
2010

MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
TOTALES
PROTEÍNAS PLASMÁTICAS
PROTEINOGRAMA
ELECTROFORESIS
WESTERN BLOT

MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES
Los métodos para medir la concentración de proteínas totales (PT) pueden clasificarse en:
1. Físicos:
• absorbancia del enlace peptídico a 190 nm: se basa en la propiedad que tiene el
enlace peptídico deabsorber a esa longitud de onda.
• absorbancia de los aminoácidos aromáticos a 280 nm: su principal limitación es
que no todas las proteínas tienen la misma proporción de estos aminoácidos, lo
que le resta exactitud.
• refractometría: método de elección, pero hoy en día en la práctica clínica se está
dejando de usar.
2. Químicos:
• reacción de Kjeldahl: considerado históricamente como elmétodo referencia.
• método de Lowry: se basa en la reducción del reactivo de Folin-Ciocalteau
provocada por el complejo unión peptídico-Cu2+ en medio alcalino con la
participación de restos fenólicos (tirosilos).
• reacción de Biuret: se fundamenta en la formación de un complejo, en medio
alcalino, entre el Cu2+ y los enlaces peptídicos (absorción a 540 nm). En la práctica
clínica, es una delas metodologías más usada para el dosaje de PT.
• métodos turbidimétricos (precipitación con ácido tricloroacético-TCA o
sulfosalicílico)
• método de Bradford
En el Trabajo Práctico se determinará la concentración de proteínas por el Método de
Bradford.
Fundamento: es una técnica sensible que consiste en la medición de la extinción
provocada por el cambio en el espectro visible de uncolorante (Coomasie Blue G-250)
cuando éste se une a las proteínas (absorbiendo así a 595 nm). Esta unión se realiza a
través de grupos ionizados y se comprueba proporcionalidad con la concentración de
proteínas contenidas en la muestra.
La determinación del contenido proteico de una muestra requiere la comparación del valor
de absorbancia de la muestra con los obtenidos a partir de cantidadesconocidas de
proteínas, con los que se construye una curva de calibración: a mayor cantidad de
proteínas, mayor color desarrollado y por lo tanto, mayor absorbancia. Recordar que esta
proporcionalidad es sólo lineal hasta un cierto límite de concentración.
Para construir la curva de calibración se requiere contar con un solución testigo de
proteína de concentración conocida (generalmente seutiliza albúmina sérica bovina o
inmunoglobulina G). Se preparan por lo menos 4 tubos testigos con distintas cantidades
de proteínas (T1, T2, T3 y T4) y otro tubo denominado blanco (en el cual el volumen de la
solución de proteínas se reemplaza por agua). En forma simultánea, se procesan las
muestras incógnitas. Luego se agrega la misma cantidad del reactivo de Bradford a cada
tubo (dado que endefinitiva se compara el color desarrollado evidenciado por la
absorbancia de la solución en cada tubo, sus volúmenes finales deben ser iguales).

Protocolo ejemplo de determinación de proteínas por el método de Bradford:
Una vez preparados los tubos, se lee la absorbancia de cada uno de ellos a la
longitud de onda de 595 nm. La absorbancia obtenida en el tubo blanco debe ser restada
a cadauno de los tubos restantes. Una opción es calibrar el equipo con el tubo blanco:
esto consiste en asignar a la absorbancia del blanco, una lectura igual a cero. De esta
manera, automáticamente esta lectura es “restada” por el fotocolorímetro a todas las
muestras posteriormente leídas en el equipo. Los resultados obtenidos se vuelcan en una
tabla como la que sigue.

Con las absorbancias delos tubos testigos obtenidas en el fotocolorímetro, se
construye el gráfico de Absorbancia a 595 nm en función de la cantidad de proteína (mg).
En el ejemplo, los tubos conteniendo testigos 4 y 5 muestran una desviación de la zona
lineal de cumplimiento de la Ley de Lambert- Beer, motivo por el cual no se consideran al
trazar la recta promedio.
Para determinar la concentración de proteínas...