Metodo general de micropropagacion

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APARTADO_: METODO GENERAL DE MICROPROPAGACIÓN

PREPARACIÓN PARA EL ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO

Manejo de las plantas madres

Hay que tener dos consideraciones principales. Una es reducir el potencial de contaminación por hongos, bacterias, virus y otros patógenos. Otra, es el control de la condición fisiológica del explante.

Las plantas madres deben estar sanas y en crecimientorelativamente activo, que no estén o vayan entrando en letargo.

Selección del explante

El tipo de explante y su ubicación en la planta madre, varían mucho con el objetivo del cultivo, así como con las especies. Para la obtención de puntas de tallos las plantas más convenientes son aquellas que están en crecimiento activo. En el cultivo de puntas de tallo el explante puede consistir en todo o partede un punto de crecimiento apical o lateral, o puede ser una porción de tallo con varios nudos. El tipo más común es una punta de tallo no expandida, con longitud de 0,5 a 2 mm. Otro tipo son secciones de punta de tallo inmaduro en expansión de 1 a 2 cm, incluyendo hojas inmaduras. En ambos casos es posible que no esté libre de virus. Los explantes de puntas de tallo se pueden tomar también desegmentos de yemas laterales, que esencialmente son estacas de un solo nudo.

En el cultivo de ápices meristemáticos el objeto es producir una plantita pequeña con raíces, que estén libres de hongos, bacterias y virus que no estén presentes en el meristema. El tamaño puede ser de 0,25 a 1 mm.

Otro tipo de explante puede ser una sección nodal que tenga una yema lateral.

También se puedenutilizar para obtener explantes, trozos de hojas, escamas de bulbos, escapos florales y cotiledones.

Desinfestación

Los desinfectantes primarios son alcoholes (etílico, metílico, isopropílico) y los hipocloritos de calcio o sodio. La efectividad de la desinfección es una respuesta de tiempo y dosis, aumentando la efectividad al aumentar ambos factores, pero la capacidad para dañar tejidostambién aumenta. En consecuencia, se debe buscar un equilibrio según el tipo de explante que se trate.

Durante la propagación de puntas de tallo, un procedimiento de desinfestación típico consiste en cortar el brote en trozos de varios centímetros y sumergirlos en alcohol (del 70 al 95 %) para darles una esterilización superficial preliminar. Después, las porciones de planta se colocan en la solucióndesinfectante agregando un detergente; valores de hipoclorito de calcio del 9 a 10% o de hipoclorito de sodio al 2% se emplean con tiempos de 5 a 30 minutos. Luego se escurre la solución y el material se enjuaga 2 o 3 veces con agua estéril.

Los contaminantes son levaduras y varias especies de hongos y bacterias. Cuando estos contaminantes se pueden identificar visualmente, hay que descartarde inmediato los cultivos que los contienen. Los recipientes de cultivo contaminados se esterilizan en la autoclave sin destaparlos para evitar contaminar el laboratorio.

Procedimiento aséptico.

Los trabajos de transferencia aséptica se hacen en campana de flujo laminar. Los lados y las superficies de dicha cámara se deben lavar con un desinfectante. Se deberán lavar las manos, los brazos yusar guantes y una bata de laboratorio limpia. El instrumental se deberá limpiar con desinfectantes.

Preparación del explante.

El método exacto de preparación del explante varía según la clase de la planta. Si se van a usar puntas de tallo sáquense los trozos de tallo desinfectados de la solución de enjuague y córtense las hojas que lo cubren con escalpelos esterilizados para exponer la puntainmadura.

La separación del ápice meristemático, requiere el empleo de microherramientas muy delicadas y el uso del microscopio de disección. Si como explante se usa una porción más grande del meristemo, la operación es menos delicada y exigente.

En cualquiera de los casos, el trabajo debe hacerse con rapidez y el trozo se debe insertar en el agar-agar con mucha prontitud, para reducir...
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